傳統抗癌策略（例如化學療法和放射療法）伴隨著功效和不良副作用的長期存在的問題，迫切要求探索和開發新的高性能方法。近來，光熱療法（PTT）由于其最小的侵襲性，時空精確度，可復制的活性，對耐藥性的忽略不計以及僅限于目標區域的光毒性的特殊優勢而受到越來越多的關注。考慮到較低的生物毒性和較高的組織穿透深度，近紅外光（NIR）始終用于PTT治療。可以通過光敏劑（如吲哚菁綠，金納米棒和硫化銅）通過振動松弛，表面等離振子共振或晶格結構將光能轉換為熱，并且可以在腫瘤部位有效地產生高熱殺死腫瘤細胞。

為了改善光敏劑在腫瘤部位的蓄積，已開發出許多類型的納米級載體，以利用腫瘤血管異常開口和缺陷引起的隨機泄漏的增強的滲透性和保留作用。靶向配體的進一步功能化使得這些納米載體能夠進一步賦予對腫瘤細胞的活性親和力，從而提供了優化抗癌潛能的潛力。

盡管有前途，基于納米載體的PTT仍然面臨一系列關鍵問題。例如，當前的主動靶向方法高度依賴于成功鑒定在腫瘤細胞上特異性表達的受體。不幸的是，癌癥異質性，特別是在腫瘤發展過程中和/或在不同腫瘤和患者之間這些受體的不穩定和非均質表達，大大損害了靶向效率。此外，納米載體在腫瘤內的滲透受到緊密的細胞外基質及其相關的異常高的組織間隙壓力的限制。因此，在大多數情況下，完全消融大腫瘤非常困難。因此，為了改進這些方法，至關重要的是開發新的基于PTT的藥物，這些藥物應可靠地富集并滲透到腫瘤部位，并通過累加甚至協同作用顯示出更高的治療功效。

最近，血小板（PLT）已通過多種機制用作有效的抗癌載體，例如血管內皮粘附，手術損傷引起的聚集以及活化后分泌的納米級囊泡。PLT用于通過血管粘附實現抗體向腫瘤的靶向遞送，從而抑制了腫瘤的生長。在PTT方面，最近的研究表明，體溫過高可以誘導腫瘤細胞釋放抗原。這種反應不僅揭示了PTT潛在機制與免疫激活之間的內在聯系，而且還鼓勵將PTT與免疫療法相結合以改善抗癌治療。

受這些基于PLT的藥物遞送以及PTT與免疫療法協同機制的研究的啟發，中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室馬光輝課題組報告了仿生PLT庫用于聯合癌癥治療的發展。在此結構中，將嵌段共聚物萘二酰亞胺-聯噻吩衍生物（NDI-BT）設計為光熱材料，然后合成光熱納米顆粒（N）并將其與免疫刺激劑R837鹽酸鹽（R）一起整合到PLT中，構造工程化的PLT（N + R @ PLT）。靜脈注射后，N + R @ PLTs在血液中起循環前哨的作用，并對血管損傷具有敏感的反應。由于腫瘤組織附近的血管內皮細胞之間的連接總是被缺陷所削弱，因此一部分N + R @ PLT可以充當矛頭來引發這些血管內皮細胞的粘附，從而最初將N + R貨物轉運至血管內皮細胞。

用NIR照射后，局部熱療會導致急性血管損傷，隨后引起聚集級聯反應，從而在腫瘤血管處形成阻塞。在這方面，有可能以更多依賴反饋的方式招募更多增強型PLT，從而使N + R貨物的進一步積累能夠就地形成。隨后，在這些激活的PLT上進一步從質膜上產生納米級前血小板（nPLT），這些前血小板將貨物轉移到深部腫瘤組織中，擴大了侵襲面積。PTT誘發腫瘤消融后，釋放的腫瘤相關抗原的免疫原性會誘導人體對殘留，轉移性和復發性腫瘤的免疫應答。在免疫刺激劑R的幫助下，這種作用得到了顯著改善。

該研究系統地驗證了PLTs的上述優點以及N和R在體內的協同作用，并在9種不同的小鼠模型中證明了有效的治療作用。最值得注意的是，該研究還證明了在基于人源化小鼠和患者源性腫瘤異種移植物（PDX）的復雜模型中，使用人PLT（hPLTs）的N + R @ hPLT ?arsenal的功效。總之，這些結果顯示了在高性能和抗癌聯合療法中使用仿生PLT平臺的巨大前景。

題目：Near-infrared light–triggered platelet arsenal for combined photothermal-immunotherapy against cancer

期刊：science advances

影響因子：13.1159

PMID：33771861

通訊作者：馬光輝

作者單位：中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室

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1.光熱聚合物納米粒子的合成

為了構建目標仿生N+R@PLT平臺，作者制備了具有高光熱轉換效率的納米粒子（圖1A）。通過Suzuki反應[數-平均分子量（M_n）=163473；圖S2A]。將這種位于疏水核中的光熱共聚物和雙硬脂酰磷酸乙醇胺（DSPE）-PEG的親水聚乙二醇（PEG）段通過典型的共沉淀策略裝飾表面構建了雜化納米顆粒。所得納米顆粒呈明確的球形，平均水動力直徑約為50nm，具有明顯的單分散性和表面負電荷（圖1B和圖S2、B和C）。此外，納米顆粒對正常細胞的細胞毒性很小。確保了在體內給藥的安全性（圖S3、A和B）。

納米顆粒具有高度一致的熱穩定性和光穩定性。此外，在水介質中，這些納米粒子產生明確的光聲信號，其強度與納米粒子濃度呈完美的線性關系（圖1E），這意味著它們具有在體內引導光聲成像的潛力。

2.N+R@PLTs的結構與特征

為了使光熱納米顆粒功能化，使其具有額外的PLT反應性和免疫原性，納米顆粒被生物素修飾，而PLT膜上的CD42a被親和素標記的抗CD42a抗體預處理。作者通過細胞切片透射電鏡（TEM）成像檢測PLT內部的納米顆粒來驗證CD42a分子可以促進納米顆粒內化為PLT（圖1F中的黃色箭頭，與圖S3C中的PLT相比）。在內化過程中，還引入了均勻分散在培養基中的免疫刺激劑R837鹽酸，使得超分辨率PLT圖像中同時存在N和R信號（圖1G）。大約60個納米顆粒和480萬個R837鹽酸鹽分子被加載到每個PLT中（圖S2E）。這種內化幾乎沒有影響PLT的大小和表面電荷，忠實地保留了光熱光譜屬性（圖S2、C、F和圖1H和I）。關于PLT生理學，紅細胞與PLTs孵化后，沒有觀察到明顯的溶血（圖S3，D和E），說明其具有良好的生物相容性。此外，通過流式細胞儀（FCM）（圖1J）和熒光成像策略（圖S3F）評價N+R@PLTs激活后的聚集行為。而且作者發現，在二磷酸腺苷處理的N@PLT和N+R@PLT樣品均顯示出明顯的聚集信號增加。這一發現與天然PLTs的特性反應性高度一致，說明PLTs在加載光熱納米顆粒和免疫刺激分子后仍保持其自然響應功能。

TEM圖像進一步證明了這種反應性（圖1K，左），顯示靜息態N+R@PLTs是圓形的，沒有明顯的偽足，而活動態N+R@PLTs變得更加樹枝狀和膨脹，類似于天然PLT。此外，激活導致生成豐富的nPLT，這也被TEM和掃描電鏡（圖1K，左插圖，和圖S3G）和FCM數據證實，顯示高PLT標記物CD62P表達的納米小泡信號增加（圖1K，中）。在nPLTs中，觀察到NDI-BT納米顆粒（N）（圖S3H）。同時，N和R的特征信號也在nPLTs中被識別出來（圖1K，右），這表明這兩種成分可以被nPLTs捕獲，以便進一步的轉運。

3.體內靶向和光熱性能

在成功構建了N+R@PLTs后，作者移植了4T1三陰性乳腺癌腫瘤的小鼠在體內研究了它們的命運和表現（圖2A）。作者以低功率進行單次近紅外照射。靜脈注射后，N+R@PLTs的循環時間與天然PLTs相似，遠遠長于裸光熱納米顆粒（圖S3，I和J）。這種相對較長的持續時間促進了N+R@PLTs在血液中作為循環哨兵的功能。

由于PLT上的粘附受體（如C型凝集素樣受體2、細胞間粘附分子1和糖蛋白）和血流中的“血小板邊緣”效應，N+R@PLTs對腫瘤附近的血管損傷具有天然敏感性。結果表明，少數N+R@PLTs先鋒到腫瘤部位，峰值時間為1小時（圖S4、A、B）。局部近紅外光輻照1小時后，信號強度逐漸增加，峰值時間延長至8小時（圖2B和圖S4B）。利用這些納米粒子的光聲特性，通過光聲成像也觀察到了類似的結果。例如，經過10分鐘的照射治療后，腫瘤部位的光聲信號比初始信號增加了10倍，這表明由于局部熱療引起的急性血管損傷，N+R@PLTs積累了更多的量（圖2C）。為了驗證，作者通過多光子共聚焦顯微鏡評估了N+R@PLT的命運（圖2D），結果顯示，最初，第一個檢測到的N+R@PLTs附著在腫瘤血管壁，這歸因于它們與腫瘤血管內皮細胞的親和力。近紅外照射后，可觀察到腫瘤血管閉塞，提示有大量N+R@PLT聚集。

考慮到PLTs激活后分泌的nPLTs可以從腫瘤血管外滲，并進一步滲透到腫瘤深處（圖S4C），因此，這些納米囊泡中的N和R物質可以運輸到腫瘤深層組織中，這可以通過免疫組化（IHC）腫瘤切片中N和R信號的共定位來證實（圖2E）。這種自我強化和子代在腫瘤周圍產生了強大的武器，除了提供一種機制來克服對腫瘤內浸潤的抵抗，這阻礙了傳統的細胞介導的傳遞系統。擴張的攻擊區域導致了實體腫瘤的強效熱療（圖2F）。與自然PLT組的穩定溫度相比，N（L）組由于靶向性較差，在10min內溫度出現了適度上升（至44℃）。值得注意的是，作者觀察到 N+R@PLT組，溫度迅速增加到56°C（圖S3K），導致熱休克蛋白（HSP）在腫瘤組織中表達最高（圖2G）。

4.光熱治療后的免疫反應

作者還評估了PTT引起的免疫反應（圖3A）。考慮到細胞因子作為免疫反應指標的效用，監測了白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-ɑ（TNF-ɑ）的血清水平（圖3B）。N（L）處理對細胞因子產生的影響很小，因為N在腫瘤部位的積累較低，隨后的光熱效應較低。由于激光照射誘導的PLT聚集改善了腫瘤的積聚（圖S4、D和E），隨后光熱效應增強（圖2F和圖S3K），N@PLTs（L）組的這種效應得到了改善。在N+R@PLT組，無激光照射排除局部熱療效應，細胞因子中度升高僅歸因于負荷R。這兩個方面的協同作用下，N+R@PLTs（L）組IL-6和TNF-ɑ的水平進一步增加，但仍在正常范圍內，表明引發了安全有效的免疫反應。

作者選擇血清細胞因子水平在第3天達到峰值這個時間點對腫瘤引流淋巴結（TLN）進行詳細研究，TLN位于腫瘤的直接下游，可以從免疫抑制重構為免疫刺激，用于抗癌免疫治療。如圖3C所示，在對照組中幾乎未檢測到腫瘤抗原（TA）的征象，而在N-based PTT[N（L）]組中僅發現少量信號。相比之下，PTT單方式治療[N@PLTs（L）]或免疫刺激（N+R@PLTs）可在樹突狀細胞（DCs）中產生更多分散的TA信號。聯合處理[N+R@PLTs（L）]，大量暴露的TA被轉運到TLN，增加了樹突狀細胞的攝取，伴隨著最高水平的樹突狀細胞成熟（圖3D中由CD80和CD86表示）。相應地，通過Ki67染色，作者檢測到整個TLN中存在大量的免疫細胞增殖（圖3E）。CFSE進一步定量顯示，N+R@PLTs（L）組中有84.9%的CD8⁺T細胞增殖，而其他組的增殖效率在40%以下（圖3F）。結果表明，在N+R@PLTs（L）組中，更多來自免疫刺激TLN的CD8⁺T細胞浸潤到腫瘤中（圖3G），表明其優越的免疫治療效果補充了PTT的性能。

5.對各種小鼠腫瘤模型的治療作用

作者系統地評估了PLTs在不同小鼠模型中的治療效果，以確定這種治療是否能夠適應廣泛的臨床抗癌需求。安全性評估研究表明，在荷瘤小鼠或非荷瘤小鼠的器官、血清、凝血能力、溫度和體重中觀察到很少異常（圖S6和S7），從而證實了作者制備的仿生PLT制劑的安全性。

為了進一步證實工程化PLTs對光熱抗癌療法的優越性，作者將一種典型的光熱劑Au納米棒（A）納入了比較，該試劑被PLT膜包裹（A@PM）或根據先前報道的基于PLT的配方裝載到整個PLT（A+R@PLTs）中（圖S8）。A+R@PM、A+R@PM（L）、A+R@PLTs（L）三組均加入相同的佐劑鹽酸R837，以匹配聯合免疫治療（圖S8、A、B）。A+R@PM（L）和A+R@PLTs（L）的治療效果均顯著低于N+R@PLTs（L）（圖S8，C至E）。更大的成功在于對N+R@PLT-based PTT配方[N+R@PLTs（L）組]進行了以下改進：首先，光熱材料NDI-BT納米顆粒表現出更高的光熱轉換效率（圖S8，F to H）。因此，與A+R@PM（L）組和A+R@PLTs（L）組相比，單次低功率近紅外照射可有效誘導N+R@PLTs（L）組的局部熱療（圖S8I）。更重要的是，整個PLT方案顯示在自然的PLT激活下，腫瘤血管高效靶向聚集級聯，并以反饋依賴的方式不斷累積到局部熱療引起的急性血管損傷部位。此外，與基于粘附的策略相比，腫瘤部位PLT庫分泌的nPLT“后代”表現出了強穿透深層組織的能力。相比之下，A+R@PM（L）組的包膜缺乏自我強化和nPLT產生的能力，而僅通過粘附策略靶向腫瘤血管（圖S8J）。

為了模擬更先進的轉移過程，作者建立了一個血行轉移模型進行進一步的研究。通常情況下，移植了4T1腫瘤的小鼠在第7天接受不同PLT配方的單一治療，然后在第8天再次靜脈注射4T1細胞（圖4F）。由于這些4T1細胞預先表達了熒光素酶（標記為Luc-4T1），通過檢測生物發光可以同時監測原發腫瘤和肺轉移的發展（圖4，G和H）。光熱[N@PLTs（L）]和免疫（N+R@PLTs）單獨治療組對原發性腫瘤和肺轉移信號的抑制均有中等效果。相比之下，N+R@PLTs（L）聯合治療導致原發部位和轉移部位的生物發光信號消失（圖S9A），表明腫瘤細胞在全身被完全根除。相應的，N+R@PLTs（L）治療組在100天后的存活率為100%，而其他治療組的小鼠均在4~7周內死亡（圖4I）。

為了進一步探索在物理遠端腫瘤中激活光熱-免疫協同作用的潛力，作者繼續使用雙腫瘤模型（圖5A），其中單側腫瘤接受了不同PLT配方的單一治療。歷史上，這種雙腫瘤模型為傳統的光熱治療策略提出了一個挑戰性的障礙，因為這些治療通常需要直接獲取近紅外源來進行有效的治療。作者發現，在低功率的單一近紅外照射條件下，N@PLTs（L）治療僅在原發腫瘤和遠端腫瘤部位誘導了中度抑制腫瘤發展的作用（圖5B），這與在N+R@PLT免疫刺激小鼠中觀察到的相似。相應地，這兩組小鼠在大約第40天迅速死亡。相比之下，N+R@PLTs（L）組原發腫瘤和遠端腫瘤均被完全抑制，所有小鼠在第100天后仍然存活，這表明協同作用必須達到有效的治療效果（圖5C）。考慮到免疫反應通常與一種典型的持久記憶效應相關，這對良好的癌癥預后至關重要，繼續評估PLTs誘導的長期抗癌免疫（圖5D）。作為對照，用4T1細胞攻擊健康小鼠可誘導腫瘤快速發展，并在隨后的4周內逐漸死亡（圖5E）。當小鼠被移植4T1腫瘤時，接受N+R@PLTs（L）單次治療后，作者觀察到脾中效應記憶T細胞顯著增加，甚至在50天后（圖5F）。在建立長期免疫記憶后，隨后用4T1腫瘤細胞再次處理后，對側腹的腫瘤形成完全抑制，100天存活率為100%（圖5G）。

手術切除后殘留的腫瘤細胞經常導致腫瘤復發，是臨床常見的問題。為了解決這個問題，作者接下來研究了PLT平臺在預防術后復發方面的適用性。為此，作者通過手術切除大部分原發腫瘤建立了復發模型（圖5H）。相應的，手術后治療組間剩余的Luc-4T1細胞信號強度幾乎相等。與前期實驗一致，PBS組的生物發光信號在隨后的2周內繼續擴散，惡性腫瘤復發，患者的生存率為0%（圖5I）。然而，N+R@PLTs（L）方案在手術不完全切除后立即實施，殘余生物發光信號在1周內完全消失（圖S9B）。相應的，所有小鼠都保持無腫瘤，在長期（100天）觀察期間存活率為100%。除4T1乳腺癌外，作者還在CT26結直腸癌、B16黑色素瘤、Lewis肺癌（LLC）和肝癌-22（H22）模型中驗證了這種有效的抗復發作用，從而驗證了基于PLT仿生平臺的抗癌功效的普遍性（圖5， J 到 M）。

6.構建基于hPLT的制劑并在復雜的人源化PDX模型中驗證療效

為了進一步證實作者的PLT平臺