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傳統(tǒng)抗癌策略（例如化學(xué)療法和放射療法）伴隨著功效和不良副作用的長期存在的問題，迫切要求探索和開發(fā)新的高性能方法。近來，光熱療法（PTT）由于其最小的侵襲性，時(shí)空精確度，可復(fù)制的活性，對(duì)耐藥性的忽略不計(jì)以及僅限于目標(biāo)區(qū)域的光毒性的特殊優(yōu)勢(shì)而受到越來越多的關(guān)注。考慮到較低的生物毒性和較高的組織穿透深度，近紅外光（NIR）始終用于PTT治療。可以通過光敏劑（如吲哚菁綠，金納米棒和硫化銅）通過振動(dòng)松弛，表面等離振子共振或晶格結(jié)構(gòu)將光能轉(zhuǎn)換為熱，并且可以在腫瘤部位有效地產(chǎn)生高熱殺死腫瘤細(xì)胞。

為了改善光敏劑在腫瘤部位的蓄積，已開發(fā)出許多類型的納米級(jí)載體，以利用腫瘤血管異常開口和缺陷引起的隨機(jī)泄漏的增強(qiáng)的滲透性和保留作用。靶向配體的進(jìn)一步功能化使得這些納米載體能夠進(jìn)一步賦予對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性親和力，從而提供了優(yōu)化抗癌潛能的潛力。

盡管有前途，基于納米載體的PTT仍然面臨一系列關(guān)鍵問題。例如，當(dāng)前的主動(dòng)靶向方法高度依賴于成功鑒定在腫瘤細(xì)胞上特異性表達(dá)的受體。不幸的是，癌癥異質(zhì)性，特別是在腫瘤發(fā)展過程中和/或在不同腫瘤和患者之間這些受體的不穩(wěn)定和非均質(zhì)表達(dá)，大大損害了靶向效率。此外，納米載體在腫瘤內(nèi)的滲透受到緊密的細(xì)胞外基質(zhì)及其相關(guān)的異常高的組織間隙壓力的限制。因此，在大多數(shù)情況下，完全消融大腫瘤非常困難。因此，為了改進(jìn)這些方法，至關(guān)重要的是開發(fā)新的基于PTT的藥物，這些藥物應(yīng)可靠地富集并滲透到腫瘤部位，并通過累加甚至協(xié)同作用顯示出更高的治療功效。

最近，血小板（PLT）已通過多種機(jī)制用作有效的抗癌載體，例如血管內(nèi)皮粘附，手術(shù)損傷引起的聚集以及活化后分泌的納米級(jí)囊泡。PLT用于通過血管粘附實(shí)現(xiàn)抗體向腫瘤的靶向遞送，從而抑制了腫瘤的生長。在PTT方面，最近的研究表明，體溫過高可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放抗原。這種反應(yīng)不僅揭示了PTT潛在機(jī)制與免疫激活之間的內(nèi)在聯(lián)系，而且還鼓勵(lì)將PTT與免疫療法相結(jié)合以改善抗癌治療。

受這些基于PLT的藥物遞送以及PTT與免疫療法協(xié)同機(jī)制的研究的啟發(fā)，中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室馬光輝課題組報(bào)告了仿生PLT庫用于聯(lián)合癌癥治療的發(fā)展。在此結(jié)構(gòu)中，將嵌段共聚物萘二酰亞胺-聯(lián)噻吩衍生物（NDI-BT）設(shè)計(jì)為光熱材料，然后合成光熱納米顆粒（N）并將其與免疫刺激劑R837鹽酸鹽（R）一起整合到PLT中，構(gòu)造工程化的PLT（N + R @ PLT）。靜脈注射后，N + R @ PLTs在血液中起循環(huán)前哨的作用，并對(duì)血管損傷具有敏感的反應(yīng)。由于腫瘤組織附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接總是被缺陷所削弱，因此一部分N + R @ PLT可以充當(dāng)矛頭來引發(fā)這些血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而最初將N + R貨物轉(zhuǎn)運(yùn)至血管內(nèi)皮細(xì)胞。

用NIR照射后，局部熱療會(huì)導(dǎo)致急性血管損傷，隨后引起聚集級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而在腫瘤血管處形成阻塞。在這方面，有可能以更多依賴反饋的方式招募更多增強(qiáng)型PLT，從而使N + R貨物的進(jìn)一步積累能夠就地形成。隨后，在這些激活的PLT上進(jìn)一步從質(zhì)膜上產(chǎn)生納米級(jí)前血小板（nPLT），這些前血小板將貨物轉(zhuǎn)移到深部腫瘤組織中，擴(kuò)大了侵襲面積。PTT誘發(fā)腫瘤消融后，釋放的腫瘤相關(guān)抗原的免疫原性會(huì)誘導(dǎo)人體對(duì)殘留，轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性腫瘤的免疫應(yīng)答。在免疫刺激劑R的幫助下，這種作用得到了顯著改善。

該研究系統(tǒng)地驗(yàn)證了PLTs的上述優(yōu)點(diǎn)以及N和R在體內(nèi)的協(xié)同作用，并在9種不同的小鼠模型中證明了有效的治療作用。最值得注意的是，該研究還證明了在基于人源化小鼠和患者源性腫瘤異種移植物（PDX）的復(fù)雜模型中，使用人PLT（hPLTs）的N + R @ hPLT ?arsenal的功效。總之，這些結(jié)果顯示了在高性能和抗癌聯(lián)合療法中使用仿生PLT平臺(tái)的巨大前景。

題目：Near-infrared light–triggered platelet arsenal for combined photothermal-immunotherapy against cancer

期刊：science advances

影響因子：13.1159

PMID：33771861

通訊作者：馬光輝

作者單位：中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

索萊寶合作產(chǎn)品：

1.光熱聚合物納米粒子的合成

為了構(gòu)建目標(biāo)仿生N+R@PLT平臺(tái)，作者制備了具有高光熱轉(zhuǎn)換效率的納米粒子（圖1A）。通過Suzuki反應(yīng)[數(shù)-平均分子量（M_n）=163473；圖S2A]。將這種位于疏水核中的光熱共聚物和雙硬脂酰磷酸乙醇胺（DSPE）-PEG的親水聚乙二醇（PEG）段通過典型的共沉淀策略裝飾表面構(gòu)建了雜化納米顆粒。所得納米顆粒呈明確的球形，平均水動(dòng)力直徑約為50nm，具有明顯的單分散性和表面負(fù)電荷（圖1B和圖S2、B和C）。此外，納米顆粒對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性很小。確保了在體內(nèi)給藥的安全性（圖S3、A和B）。

納米顆粒具有高度一致的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。此外，在水介質(zhì)中，這些納米粒子產(chǎn)生明確的光聲信號(hào)，其強(qiáng)度與納米粒子濃度呈完美的線性關(guān)系（圖1E），這意味著它們具有在體內(nèi)引導(dǎo)光聲成像的潛力。

2.N+R@PLTs的結(jié)構(gòu)與特征

為了使光熱納米顆粒功能化，使其具有額外的PLT反應(yīng)性和免疫原性，納米顆粒被生物素修飾，而PLT膜上的CD42a被親和素標(biāo)記的抗CD42a抗體預(yù)處理。作者通過細(xì)胞切片透射電鏡（TEM）成像檢測PLT內(nèi)部的納米顆粒來驗(yàn)證CD42a分子可以促進(jìn)納米顆粒內(nèi)化為PLT（圖1F中的黃色箭頭，與圖S3C中的PLT相比）。在內(nèi)化過程中，還引入了均勻分散在培養(yǎng)基中的免疫刺激劑R837鹽酸，使得超分辨率PLT圖像中同時(shí)存在N和R信號(hào)（圖1G）。大約60個(gè)納米顆粒和480萬個(gè)R837鹽酸鹽分子被加載到每個(gè)PLT中（圖S2E）。這種內(nèi)化幾乎沒有影響PLT的大小和表面電荷，忠實(shí)地保留了光熱光譜屬性（圖S2、C、F和圖1H和I）。關(guān)于PLT生理學(xué)，紅細(xì)胞與PLTs孵化后，沒有觀察到明顯的溶血（圖S3，D和E），說明其具有良好的生物相容性。此外，通過流式細(xì)胞儀（FCM）（圖1J）和熒光成像策略（圖S3F）評(píng)價(jià)N+R@PLTs激活后的聚集行為。而且作者發(fā)現(xiàn)，在二磷酸腺苷處理的N@PLT和N+R@PLT樣品均顯示出明顯的聚集信號(hào)增加。這一發(fā)現(xiàn)與天然PLTs的特性反應(yīng)性高度一致，說明PLTs在加載光熱納米顆粒和免疫刺激分子后仍保持其自然響應(yīng)功能。

TEM圖像進(jìn)一步證明了這種反應(yīng)性（圖1K，左），顯示靜息態(tài)N+R@PLTs是圓形的，沒有明顯的偽足，而活動(dòng)態(tài)N+R@PLTs變得更加樹枝狀和膨脹，類似于天然PLT。此外，激活導(dǎo)致生成豐富的nPLT，這也被TEM和掃描電鏡（圖1K，左插圖，和圖S3G）和FCM數(shù)據(jù)證實(shí)，顯示高PLT標(biāo)記物CD62P表達(dá)的納米小泡信號(hào)增加（圖1K，中）。在nPLTs中，觀察到NDI-BT納米顆粒（N）（圖S3H）。同時(shí)，N和R的特征信號(hào)也在nPLTs中被識(shí)別出來（圖1K，右），這表明這兩種成分可以被nPLTs捕獲，以便進(jìn)一步的轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.體內(nèi)靶向和光熱性能

在成功構(gòu)建了N+R@PLTs后，作者移植了4T1三陰性乳腺癌腫瘤的小鼠在體內(nèi)研究了它們的命運(yùn)和表現(xiàn)（圖2A）。作者以低功率進(jìn)行單次近紅外照射。靜脈注射后，N+R@PLTs的循環(huán)時(shí)間與天然PLTs相似，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于裸光熱納米顆粒（圖S3，I和J）。這種相對(duì)較長的持續(xù)時(shí)間促進(jìn)了N+R@PLTs在血液中作為循環(huán)哨兵的功能。

由于PLT上的粘附受體（如C型凝集素樣受體2、細(xì)胞間粘附分子1和糖蛋白）和血流中的“血小板邊緣”效應(yīng)，N+R@PLTs對(duì)腫瘤附近的血管損傷具有天然敏感性。結(jié)果表明，少數(shù)N+R@PLTs先鋒到腫瘤部位，峰值時(shí)間為1小時(shí)（圖S4、A、B）。局部近紅外光輻照1小時(shí)后，信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，峰值時(shí)間延長至8小時(shí)（圖2B和圖S4B）。利用這些納米粒子的光聲特性，通過光聲成像也觀察到了類似的結(jié)果。例如，經(jīng)過10分鐘的照射治療后，腫瘤部位的光聲信號(hào)比初始信號(hào)增加了10倍，這表明由于局部熱療引起的急性血管損傷，N+R@PLTs積累了更多的量（圖2C）。為了驗(yàn)證，作者通過多光子共聚焦顯微鏡評(píng)估了N+R@PLT的命運(yùn)（圖2D），結(jié)果顯示，最初，第一個(gè)檢測到的N+R@PLTs附著在腫瘤血管壁，這歸因于它們與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的親和力。近紅外照射后，可觀察到腫瘤血管閉塞，提示有大量N+R@PLT聚集。

考慮到PLTs激活后分泌的nPLTs可以從腫瘤血管外滲，并進(jìn)一步滲透到腫瘤深處（圖S4C），因此，這些納米囊泡中的N和R物質(zhì)可以運(yùn)輸?shù)侥[瘤深層組織中，這可以通過免疫組化（IHC）腫瘤切片中N和R信號(hào)的共定位來證實(shí)（圖2E）。這種自我強(qiáng)化和子代在腫瘤周圍產(chǎn)生了強(qiáng)大的武器，除了提供一種機(jī)制來克服對(duì)腫瘤內(nèi)浸潤的抵抗，這阻礙了傳統(tǒng)的細(xì)胞介導(dǎo)的傳遞系統(tǒng)。擴(kuò)張的攻擊區(qū)域?qū)е铝藢?shí)體腫瘤的強(qiáng)效熱療（圖2F）。與自然PLT組的穩(wěn)定溫度相比，N（L）組由于靶向性較差，在10min內(nèi)溫度出現(xiàn)了適度上升（至44℃）。值得注意的是，作者觀察到 N+R@PLT組，溫度迅速增加到56°C（圖S3K），導(dǎo)致熱休克蛋白（HSP）在腫瘤組織中表達(dá)最高（圖2G）。

4.光熱治療后的免疫反應(yīng)

作者還評(píng)估了PTT引起的免疫反應(yīng)（圖3A）。考慮到細(xì)胞因子作為免疫反應(yīng)指標(biāo)的效用，監(jiān)測了白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-ɑ（TNF-ɑ）的血清水平（圖3B）。N（L）處理對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響很小，因?yàn)镹在腫瘤部位的積累較低，隨后的光熱效應(yīng)較低。由于激光照射誘導(dǎo)的PLT聚集改善了腫瘤的積聚（圖S4、D和E），隨后光熱效應(yīng)增強(qiáng)（圖2F和圖S3K），N@PLTs（L）組的這種效應(yīng)得到了改善。在N+R@PLT組，無激光照射排除局部熱療效應(yīng)，細(xì)胞因子中度升高僅歸因于負(fù)荷R。這兩個(gè)方面的協(xié)同作用下，N+R@PLTs（L）組IL-6和TNF-ɑ的水平進(jìn)一步增加，但仍在正常范圍內(nèi)，表明引發(fā)了安全有效的免疫反應(yīng)。

作者選擇血清細(xì)胞因子水平在第3天達(dá)到峰值這個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)腫瘤引流淋巴結(jié)（TLN）進(jìn)行詳細(xì)研究，TLN位于腫瘤的直接下游，可以從免疫抑制重構(gòu)為免疫刺激，用于抗癌免疫治療。如圖3C所示，在對(duì)照組中幾乎未檢測到腫瘤抗原（TA）的征象，而在N-based PTT[N（L）]組中僅發(fā)現(xiàn)少量信號(hào)。相比之下，PTT單方式治療[N@PLTs（L）]或免疫刺激（N+R@PLTs）可在樹突狀細(xì)胞（DCs）中產(chǎn)生更多分散的TA信號(hào)。聯(lián)合處理[N+R@PLTs（L）]，大量暴露的TA被轉(zhuǎn)運(yùn)到TLN，增加了樹突狀細(xì)胞的攝取，伴隨著最高水平的樹突狀細(xì)胞成熟（圖3D中由CD80和CD86表示）。相應(yīng)地，通過Ki67染色，作者檢測到整個(gè)TLN中存在大量的免疫細(xì)胞增殖（圖3E）。CFSE進(jìn)一步定量顯示，N+R@PLTs（L）組中有84.9%的CD8⁺T細(xì)胞增殖，而其他組的增殖效率在40%以下（圖3F）。結(jié)果表明，在N+R@PLTs（L）組中，更多來自免疫刺激TLN的CD8⁺T細(xì)胞浸潤到腫瘤中（圖3G），表明其優(yōu)越的免疫治療效果補(bǔ)充了PTT的性能。

5.對(duì)各種小鼠腫瘤模型的治療作用

作者系統(tǒng)地評(píng)估了PLTs在不同小鼠模型中的治療效果，以確定這種治療是否能夠適應(yīng)廣泛的臨床抗癌需求。安全性評(píng)估研究表明，在荷瘤小鼠或非荷瘤小鼠的器官、血清、凝血能力、溫度和體重中觀察到很少異常（圖S6和S7），從而證實(shí)了作者制備的仿生PLT制劑的安全性。

為了進(jìn)一步證實(shí)工程化PLTs對(duì)光熱抗癌療法的優(yōu)越性，作者將一種典型的光熱劑Au納米棒（A）納入了比較，該試劑被PLT膜包裹（A@PM）或根據(jù)先前報(bào)道的基于PLT的配方裝載到整個(gè)PLT（A+R@PLTs）中（圖S8）。A+R@PM、A+R@PM（L）、A+R@PLTs（L）三組均加入相同的佐劑鹽酸R837，以匹配聯(lián)合免疫治療（圖S8、A、B）。A+R@PM（L）和A+R@PLTs（L）的治療效果均顯著低于N+R@PLTs（L）（圖S8，C至E）。更大的成功在于對(duì)N+R@PLT-based PTT配方[N+R@PLTs（L）組]進(jìn)行了以下改進(jìn)：首先，光熱材料NDI-BT納米顆粒表現(xiàn)出更高的光熱轉(zhuǎn)換效率（圖S8，F(xiàn) to H）。因此，與A+R@PM（L）組和A+R@PLTs（L）組相比，單次低功率近紅外照射可有效誘導(dǎo)N+R@PLTs（L）組的局部熱療（圖S8I）。更重要的是，整個(gè)PLT方案顯示在自然的PLT激活下，腫瘤血管高效靶向聚集級(jí)聯(lián)，并以反饋依賴的方式不斷累積到局部熱療引起的急性血管損傷部位。此外，與基于粘附的策略相比，腫瘤部位PLT庫分泌的nPLT“后代”表現(xiàn)出了強(qiáng)穿透深層組織的能力。相比之下，A+R@PM（L）組的包膜缺乏自我強(qiáng)化和nPLT產(chǎn)生的能力，而僅通過粘附策略靶向腫瘤血管（圖S8J）。

為了模擬更先進(jìn)的轉(zhuǎn)移過程，作者建立了一個(gè)血行轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行進(jìn)一步的研究。通常情況下，移植了4T1腫瘤的小鼠在第7天接受不同PLT配方的單一治療，然后在第8天再次靜脈注射4T1細(xì)胞（圖4F）。由于這些4T1細(xì)胞預(yù)先表達(dá)了熒光素酶（標(biāo)記為Luc-4T1），通過檢測生物發(fā)光可以同時(shí)監(jiān)測原發(fā)腫瘤和肺轉(zhuǎn)移的發(fā)展（圖4，G和H）。光熱[N@PLTs（L）]和免疫（N+R@PLTs）單獨(dú)治療組對(duì)原發(fā)性腫瘤和肺轉(zhuǎn)移信號(hào)的抑制均有中等效果。相比之下，N+R@PLTs（L）聯(lián)合治療導(dǎo)致原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位的生物發(fā)光信號(hào)消失（圖S9A），表明腫瘤細(xì)胞在全身被完全根除。相應(yīng)的，N+R@PLTs（L）治療組在100天后的存活率為100%，而其他治療組的小鼠均在4~7周內(nèi)死亡（圖4I）。

為了進(jìn)一步探索在物理遠(yuǎn)端腫瘤中激活光熱-免疫協(xié)同作用的潛力，作者繼續(xù)使用雙腫瘤模型（圖5A），其中單側(cè)腫瘤接受了不同PLT配方的單一治療。歷史上，這種雙腫瘤模型為傳統(tǒng)的光熱治療策略提出了一個(gè)挑戰(zhàn)性的障礙，因?yàn)檫@些治療通常需要直接獲取近紅外源來進(jìn)行有效的治療。作者發(fā)現(xiàn)，在低功率的單一近紅外照射條件下，N@PLTs（L）治療僅在原發(fā)腫瘤和遠(yuǎn)端腫瘤部位誘導(dǎo)了中度抑制腫瘤發(fā)展的作用（圖5B），這與在N+R@PLT免疫刺激小鼠中觀察到的相似。相應(yīng)地，這兩組小鼠在大約第40天迅速死亡。相比之下，N+R@PLTs（L）組原發(fā)腫瘤和遠(yuǎn)端腫瘤均被完全抑制，所有小鼠在第100天后仍然存活，這表明協(xié)同作用必須達(dá)到有效的治療效果（圖5C）。考慮到免疫反應(yīng)通常與一種典型的持久記憶效應(yīng)相關(guān)，這對(duì)良好的癌癥預(yù)后至關(guān)重要，繼續(xù)評(píng)估PLTs誘導(dǎo)的長期抗癌免疫（圖5D）。作為對(duì)照，用4T1細(xì)胞攻擊健康小鼠可誘導(dǎo)腫瘤快速發(fā)展，并在隨后的4周內(nèi)逐漸死亡（圖5E）。當(dāng)小鼠被移植4T1腫瘤時(shí)，接受N+R@PLTs（L）單次治療后，作者觀察到脾中效應(yīng)記憶T細(xì)胞顯著增加，甚至在50天后（圖5F）。在建立長期免疫記憶后，隨后用4T1腫瘤細(xì)胞再次處理后，對(duì)側(cè)腹的腫瘤形成完全抑制，100天存活率為100%（圖5G）。

手術(shù)切除后殘留的腫瘤細(xì)胞經(jīng)常導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，是臨床常見的問題。為了解決這個(gè)問題，作者接下來研究了PLT平臺(tái)在預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)方面的適用性。為此，作者通過手術(shù)切除大部分原發(fā)腫瘤建立了復(fù)發(fā)模型（圖5H）。相應(yīng)的，手術(shù)后治療組間剩余的Luc-4T1細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度幾乎相等。與前期實(shí)驗(yàn)一致，PBS組的生物發(fā)光信號(hào)在隨后的2周內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)散，惡性腫瘤復(fù)發(fā)，患者的生存率為0%（圖5I）。然而，N+R@PLTs（L）方案在手術(shù)不完全切除后立即實(shí)施，殘余生物發(fā)光信號(hào)在1周內(nèi)完全消失（圖S9B）。相應(yīng)的，所有小鼠都保持無腫瘤，在長期（100天）觀察期間存活率為100%。除4T1乳腺癌外，作者還在CT26結(jié)直腸癌、B16黑色素瘤、Lewis肺癌（LLC）和肝癌-22（H22）模型中驗(yàn)證了這種有效的抗復(fù)發(fā)作用，從而驗(yàn)證了基于PLT仿生平臺(tái)的抗癌功效的普遍性（圖5， J 到 M）。

6.構(gòu)建基于hPLT的制劑并在復(fù)雜的人源化PDX模型中驗(yàn)證療效

為了進(jìn)一步證實(shí)作者的PLT平臺(tái)