RNA提取及檢測
? 核糖核酸（縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。通常在細胞進行轉染后，需要進行RNA水平及蛋白水平的檢測。
? RNA的檢測即RT-qPCR，包括三大步驟：RNA的提取與濃度測定、逆轉錄為cDNA、以及實時熒光定量PCR實驗。通過RT-qPCR實驗，可以分析目的基因的轉錄水平。
? RNA提取是RT-qPCR實驗成功的首要步驟，RNA的質量直接決定RT-qPCR的結果。在實驗中我們需要注意由于RNA分子結構不穩定和周圍環境中無處不在的RNase對RNA降解造成的威脅。
圖1 RNA和DNA
RNA提取及濃度測定
1.樣本
選擇生長旺盛期的細胞，如果對細胞進行處理，一般選擇處理后48h左右的細胞；如果是組織樣本，也盡量選擇新鮮、生長旺盛的組織樣本。
2.樣本的收集及保存
獲取樣本后，最好立即提取RNA。如果細胞不能及時處理則保存于Trizol裂解液中；如果遇到不能立即處理的組織樣本，則需要將組織剪成小組織塊，在液氮中速凍1h以上，之后保存于-80℃冰箱。
3.RNA提取注意事項
避免環境中RNase的污染: 實驗臺面需要用75%的酒精擦拭干凈，操作過程需要佩戴口罩、帽子和手套等; 需要準備RNase-free的耗材。
4.常見的RNA提取方法
i沉淀法
Trizol裂解液是總RNA提取的常用試劑, 內含苯酚、異硫*酸胍等物質，能迅速破碎細胞，釋放核酸，并抑制細胞釋放的核酸酶。
1）組織中提取RNA: 第一步需要液氮研磨，將組織塊放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織塊變軟，再次加入液氮研磨，反復三至四次后加入50-100mg/ml的Trizol，轉入離心管中，室溫放置10min，使其充分裂解。12000rpm，離心5min，棄掉沉淀。細胞中提取RNA：根據細胞量加入對應的Trizol，在搖床放置10-15min后，收集到離心管中。
2）按照200ul氯仿/ml Trizol加入離心管中，混勻后室溫放置10min（切勿用渦旋振蕩儀，防止基因組DNA斷裂）。
3）4℃，12000rpm，離心15min。
4）將上層水相轉移到新的離心管中，按照500ul異丙醇/ml Trizol加入離心管中，室溫放置10min。
5）4℃，12000rpm，離心15min。
6）按照1ml 75%無水乙醇/ml Trizol，加入到離心管中，4℃，12000rpm，離心10min清洗一次RNA沉淀，室溫放置5min左右晾干（RNA不可過于干燥，否則很難溶解）。
7）加入適量DEPC水溶解RNA，在Nanodrop上測定RNA濃度。
ii試劑盒法?
主要是利用離心柱法提取RNA，具體可根據各試劑盒的說明書進行提取。主要利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，在于操作簡單，耗時短，RNA完整性好，但是有的試劑盒濃度、純度略低于沉淀法。
逆轉錄PCR
不同RNA逆轉為從cDNA的效率不同，因此選擇合適的逆轉錄試劑盒很重要。逆轉錄試劑盒通常包括逆轉錄酶、dNTP、引物等。
i逆轉錄酶
目前市場上有兩種不同的逆轉錄酶，一種來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的RNA酶活性，它最適溫度是42 ℃，最適pH 8.3。但是高水平的RNA酶活性既抑制cDNA產生也限制其長度。
另一種來源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)的逆轉錄酶，是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對較弱的RNA酶活性，最適溫度37 ℃，最適pH 7.6，較弱的RNA酶活性，可擴增2-3 kb的cDNA。
ii dNTP
? 四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)的濃度，對于有效合成cDNA是至關重要的。如果其中只有一種的濃度小于10-50 μM，cDNA的產量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-500 μM。
iii 引物
? 逆轉錄引物一般包含三種：oligo dT，Random Primer Mix和特異性引物。客戶可以根據個人需求進行選擇。Oligo-dT引物對于大多數應用是首選的，因為它確保所有cDNA拷貝終止于mRNA的3' 末端并可獲得最高產量的全長cDNA。
? 逆轉后的cDNA不需要用Nanodrop來檢測濃度與純度，因為逆轉錄后的產物是一個混合體系（含有cDNA、未完全逆轉錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分），會干擾cDNA的吸光度。此外，260 nm是核酸吸收峰最高的位置，在這個位置，1 OD（optical density，光密度）的吸光度分別相當于50 ng/μL的雙鏈DNA，37 ng/μL的單鏈DNA，40 ng/μL的RNA，30 ng/μL的寡核苷酸（dNTP）。例如，就dNTP而言，即使cDNA濃度一樣，但dNTP也會嚴重干擾其測定結果。
實時熒光定量PCR
在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中的每一個循環中產物的變化，通過CT值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析的一項技術。
CT值：qPCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時對應的擴增循環數（cycle Threshold）。CT值與模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。
基線：在PCR反應的最初的幾個循環里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即為基線。
擴增曲線：粗略來判斷擴增效率。
判斷擴增曲線是否良好的幾個指標：
1.曲線拐點清楚；
2.曲線指數期斜率與擴增效率成正比，斜率越大擴增效率越高；
3.標準的基線平直，無明顯上揚趨勢；
4.各擴增曲線平行性好。
圖2? qPCR擴增曲線
Real-time qPCR 的種類:一類為探針類，包括TaqMan?探針和分子信標，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加。一類為非探針類，其中包括如 SYBR? Green I 或者特殊設計的引物(如 LUX?Primers) 通過熒光染料來指示產物的增加。
Taqman?探針是最早用于定量的方法。就在 PCR 擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標記一個熒光報告基團 ，3’端標記一個熒光淬滅基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，也就是 FRET 反應; PCR 擴增時，Taq 酶的 5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離 ，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR 產物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP）， 有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺 。
圖3? TaqMan探針原理
? SYBR? Green I 是一種結合于小溝中的雙鏈 DNA 結合染料，與雙鏈 DNA結合后，其熒光大大增強。這一性質使其用于擴增產物的檢測非常理想。SYBR?GreenI 的最大吸收波長約為 497nm ，發射波長最大約為 520nm。在 PCR 反應體系中，SYBR? Green 熒光染料特異性地摻入DNA 雙鏈后，發射熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產物的增加完全同步。
圖4? SYBR Green染料原理
熔解曲線
熔解曲線分析可以用來確定不同的反應產物，包括非特異性產物。熔解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個特征峰就可以將特異產物與其它產物如引物二聚體區分開。
圖5? qPCR熔解曲線
品牌 | 貨號 | 中文名 |
JSENB | ES427039 | 無水乙醇 |
JSENB | JS0020 | 8-羥基喹啉 |
JSENB | JS0332 | 無菌水 |
JSENB | JS0083 | EDTA?游離酸 |
JSENB | JS0030 | 甲叉雙丙烯酰胺 |