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內(nèi)參抗體種類與選擇
作者:北京正旦國際科技有限責任公司試劑部 2012-11-26T00:00 (訪問量:17512)
內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control),對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins),它們在各組織和細胞中的表達水平相對恒定,在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting中使用內(nèi)參對應(yīng)的抗體來檢測內(nèi)參,這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達,由于內(nèi)參在各組織和細胞中 的表達相對恒定,借此,可檢測每個樣品內(nèi)參的量繼而可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用 內(nèi)參可以作為空白對照,檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。
His標簽是由6個組氨酸(His-His-His-His-His-His)組成的短肽,專門設(shè)計用于重組蛋白質(zhì)的吸附純化。由于分子量較小,并且 較容易分離和純化,His融合標簽與其他標簽相比有很多明顯優(yōu)勢,是目前用于純化的融合標簽中使用最為廣泛的一種。利 用His標簽可以建立一個基于融合蛋白的高效檢測和純化系統(tǒng)。His抗體可以用于檢測和His標簽融合表達蛋白的表達、細胞 內(nèi)定位,以及純化、定性或定量檢測His融合表達蛋白等。
GST標簽體系具有蛋白表達產(chǎn)率高、表達產(chǎn)物純化方便,以及利于GST抗體制備等特點。GST融合蛋白在水溶液中可溶,可 從細菌裂解液中提取,在不變性的條件下通過親和層折得到。GST融合蛋白可被位點特異性蛋白酶裂解,從而除去GST蛋 白。
GFP標簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端,該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種細胞類型,包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等,相應(yīng)的 GFP標簽抗體也被廣泛應(yīng)用。
Myc標簽(序列為:EQKLISEEDL)已成功應(yīng)用于WB雜交技術(shù)、免疫沉淀IP和流式細胞術(shù)中。因此可用于檢測重組蛋白在 細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳細胞中的表達情況。
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