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WB整體解決方案

作者：北京索萊寶科技有限公司--實驗室產品 2018-08-10T00:00 (訪問量:15661)

蛋白電泳
SDS-PAGE及Western blot

蛋白電泳 SDS-PAGE原理

SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質分子結合成復合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質-SDS 復合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。實驗使用過程中，還加入DTT或者巰基乙醇，以打開蛋白間的二硫鍵，破壞蛋白質的四級結構。SDS—PAGE最常采用垂直板不連續系統（分離膠與濃縮膠）。

一、樣品制備
?
注：本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合于Bradford蛋白濃度測定試劑盒，請選擇BCA法或者Lowry法。
產品貨號 產品名稱 說明
R0010 高效RIPA組織/細胞裂解液 在普通RIPA的基礎上改進而來,含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(配有一支PMSF)
R0020 RIPA組織/細胞裂解液 RIPA經典配方，適于絕大多數蛋白-蛋白相互作用的免疫實驗。組成： 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.(配有一支PMSF) 保存： 4 oC避光
R0030 非變性組織/細胞裂解液 非變性條件下裂解的蛋白產物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗體結合或酶學活性，因此適宜于進行免疫共沉淀。
R0050 核蛋白提取試劑盒 ?
BC3640 全蛋白提取試劑盒 ?
BC3720 植物蛋白提取試劑盒 ?
BC3710 全蛋白提取試劑盒（強） ?
BC3711 全蛋白提取試劑盒（中） ?
BC3730 磷酸化蛋白提取試劑盒 ?
BC3740 胞漿蛋白提取試劑盒 ?
蛋白含量測定是以標準蛋白作為對照，根據蛋白濃度不同，吸光值不同而達到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光譜吸收法）來定量，但更多的是用染料對蛋白進行染色，利用染料與蛋白結合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來定量的。后一種方法應用更普遍。蛋白定量方法的選擇，應該考慮到蛋白結構（標準品選擇）、蛋白溶液內干擾物等因素的影響。
產品貨號 產品名稱 組成 說明
PC0010 Bradford蛋白濃度測定試劑盒
5×G250染色液 100ml 2-8℃
BSA(5 mg/ml) 1ml -20oC
PBS稀釋液 30ml 2-8℃
干擾物質少， Tris、糖、甘油、巰基乙醇、氨、EDTA等均不干擾測定。
PC0020 BCA蛋白濃度測定試劑盒
BCA Reagent 100ml 2-8℃
Cu Reagent 3.0ml 2-8℃
BSA(5 mg/ml) 1ml -20oC
PBS稀釋液 30ml 2-8℃
BCA法的顯著優點是不受去垢劑的影響。
PC0030 Lowry法蛋白濃度測定試劑盒
Folin酚甲試劑A 200ml 2-8℃
Folin酚甲試劑B 5ml 2-8℃
Folin酚乙試劑 20ml 2-8℃
BSA(5 mg/ml) 1ml -20oC
PBS稀釋液 30ml 2-8℃
Lowry法測定較為不受脂類物質干擾，適于脂類含量較高的樣品測定。也能耐受相當濃度的去垢劑如SDS。
?
SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，實驗室可根據自己的情況和習慣來選擇試劑。如選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9全部試劑可自己配制。也可以選擇配制好的試劑。如10、11、12、13/14、16、9、20。還可選擇10、13/14、16、9、17、18、19、20。
系號 產品貨號 產品名稱 系號 產品貨號 產品名稱
1 T8060 TRIS 三羥甲基氨基甲烷 11 S1051 4XSDS-PAGE分離膠緩沖液（PH=8.8）
2 G8200 Glycine 甘氨酸 12 S1052 4XSDS-PAGE濃縮膠緩沖液（PH=6.8）
3 S8010 SDS 十二烷基硫酸鈉 13 P1016 4×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)
4 A8080 Acrylamide 丙烯酰胺 14 P1015 4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)
5 M8200 N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉雙丙烯酰胺 15 D1070 1M DTT
6 A8090 Ammonium Persulfate 過硫酸胺 16 A1030 10%過硫酸氨
7 D8220 DTT 二硫蘇糖醇 17 T1020 1M Tris-HCL (PH6.8)
8 M8210 β-Mercaptoethanol β-巰基乙醇 18 T1010 1.5M Tris-HCL(PH8.8)
9 T8090 TEMED 四甲基乙二胺 19 S1010 10%SDS
10 A1010 30%丙烯酰胺（29:1） 20 T1070 5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液
凝膠配制表（一）
? 分離膠12% 分離膠10% 分離膠8% 濃縮膠（3%）
總體積 10ml 10ml 10ml 5ml
4X分離膠緩沖液（PH8.8） 2.5ml 2.5ml 2.5ml 0
4X濃縮膠緩沖液（PH6.8） 0 0 0 1.25ml
30%丙烯酰胺(29:1) 4ml 3.3ml 2.7ml 0.5ml
ddH2O 3.4ml 4.1ml 4.7ml 3.2ml
10%過硫酸銨 100ul 100ul 100ul 75ul
TEMED 10ul 10ul 10ul 7.5ul
凝膠配制表（二）
? 分離膠12% 分離膠10% 分離膠8% 濃縮膠（3%）
總體積 10ml 10ml 10ml 5ml
30%丙烯酰胺(29:1) 4ml 3.3ml 2.7ml 0.5ml
1M Tris-HCL (PH6.8) 0 0 0 0.625ml
1.5M Tris-HCL(PH8.8) 2.5ml 2.5ml 2.5ml 0
10%SDS 100ul 100ul 100ul 50ul
ddH2O 3.3ml 4.0ml 4.6ml 3.75ml
10%過硫酸銨 100ul 100ul 100ul 75ul
TEMED 10ul 10ul 10ul 7.5ul
本公司的丙烯酰胺是29：1的，如需要定制其他規格的可以聯系我們。 為了客戶實驗方便，我們生產的SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（P1200）和Tris- Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（P1320），后者主要用于小于10kd的蛋白和多肽的分離。包含了制膠的全部試劑，方便客戶操作。 如果您想節省時間，也可以使用我們的預制膠，無需配膠，直接跑電泳即可。
本公司的上樣緩沖液既有用于非變性的（P1017、p1027）又有變性的（P1015、P1016、P1017、P1018），有不同的稀釋倍數，可以滿足客戶的多種實驗需求。 電泳緩沖液既有用于普通的tris-甘氨酸緩沖系統的產品（T1070），又有用于Bis-tris這種系統的MOPS緩沖液（T1510） 蛋白marker有多種，非預染marker、預染marker、彩虹marker、Western Blot Marker。而且還有GE原裝的變性非變性marker，廣泛的分子量和用途供您選擇。
產品貨號 產品名稱 產品貨號 產品名稱
P1015 4×蛋白上樣緩沖液（含DTT） P1016 4×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）
P1018 2×蛋白上樣緩沖液（含DTT） P1019 2×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）
P1017 4×非變性蛋白上樣緩沖液 p1027 2×非變性蛋白上樣緩沖液
T1070 5×Tris甘氨酸電泳緩沖液 T1510 Tris-Mops緩沖液(10×)
PR1300-15 次高分子量蛋白質標準 15T PR1400-20 低分子量蛋白質標準(14.4-97.4KD) 20T
PR1500-10 次高分子量蛋白質標準 10T PR1600-20 預染低分子量蛋白質(14.4-97.4KD) 20T
PR1700-10 預染次高分子量蛋白質標準 10T PR1800-10 Western Blot Marker 10T(50ul）
PR1900 預染超低分子量蛋白marker（3.3-31KD) 20T PR1910 彩虹180廣譜蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1)
PR1920 彩虹245廣譜蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1) PR1930 彩虹245plus廣譜蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1)
跑膠后的染色可以用銀染或者考染的方法，如果蛋白量少，推薦使用靈敏度高一些的銀染試劑盒（G7210），否則常規染色可以使用（P1305）和（P1300），其中P1300的優點是染色時間短，半小時內即可檢測到蛋白電泳條帶，節省了染色脫色的時間。
產品貨號 產品名稱
C8430 考馬斯亮藍R 250染色液
P1300 考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液
P1305 考馬斯亮藍染色套裝
G7210 PAGE凝膠銀染試劑盒
PG00810-S Precast-Gel預制膠 變性預制膠 10孔 8% 10片/盒
PG01010-S Precast-Gel預制膠 變性預制膠 10孔 10% 10片/盒
PG01210-S Precast-Gel預制膠 變性預制膠 10孔 12% 10片/盒
PG01510-S Precast-Gel預制膠 變性預制膠 10孔 15% 10片/盒
PG41510-S Precast-Gel預制膠 變性預制膠 10孔 4～15% 10片/盒
PG42010-S Precast-Gel預制膠 變性預制膠 10孔 4～20% 10片/盒
PG82010-S Precast-Gel預制膠 變性預制膠 10孔 8～20% 10片/盒
PG00810-N Precast-Gel預制膠 非變性預制膠 10孔 8% 10片/盒
PG01010-N Precast-Gel預制膠 非變性預制膠 10孔 10% 10片/盒
PG01210-N Precast-Gel預制膠 非變性預制膠 10孔 12% 10片/盒
PG01510-N Precast-Gel預制膠 非變性預制膠 10孔 15% 10片/盒
PG41510-N Precast-Gel預制膠 非變性預制膠 10孔 4-15% 10片/盒
PG42010-N Precast-Gel預制膠 非變性預制膠 10孔 4～20% 10片/盒
PG82010-N Precast-Gel預制膠 非變性預制膠 10孔 8～20% 10片/盒
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Millipore和PALL公司的尼龍膜和pvdf膜，具有0.22um和0.45um兩種規格。 轉膜后還可以用P0012（10×麗春紅）檢測轉膜效果，尤其是針對NC膜效果更佳。 為了節省成本和時間，您可以選擇本公司的SW3020（Western Blot膜再生液）對用過的膜進行清洗，隨后，可以使用不同的抗體進行下一輪Western Blot實驗。 膜再生液實質是在不影響膜上結合的抗原的條件下將抗體洗脫下來，實際操作中，膜類型、抗體類型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。 注意：適用于 ECL和類似的化學發光試劑進行的 Western 檢測。不適用于非化學發光試劑進行的 Western檢測，例如DAB，NBT/BCIP。
產品貨號 產品名稱
P0012 10×麗春紅
SW3010 膜封閉液
A1800 抗體稀釋液
A1810 一抗稀釋液
A1820 HRP標記抗體稀釋液
A1830 AP標記抗體稀釋液
A1840 熒光抗體稀釋液
T1085 1×TBST
實驗操作過程中您可以針對不同的抗體選擇上面合適的稀釋液。
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