EasyGeno單片段重組克隆試劑盒-null-資訊-生物在線

EasyGeno單片段重組克隆試劑盒

作者：上海雅吉生物科技有限公司 2021-04-01T00:00 (訪問量:5215)

??產品簡介


EasyGeno單片段重組克隆試劑盒基于DNA序列同源性進行片段重組，可快速將單個片段定向克隆到任意線性化載體中。通過精心設計和嚴格試驗，本試劑盒含有的2×EasyGeno Single Assembly Mix具有的酶活性可將載體和片段的同源區域從雙鏈的3’端進行重組連接，終得到的無缺口閉環質?？芍苯愚D化感受態細胞篩選克隆。該方案克服了酶切位點的限制，僅需在插入片段PCR引物5’端引入線性化載體的末端序列，使得插入片段5’和3’兩端帶有載體兩端的致性序列（15-25 bp），即可實現插入片段的定向重組進入載體。重組反應可在恒溫條件下快速進行（50?℃處理15 min），配合靈活的PCR產物處理方式和快速轉化方法，數小時內即可完成從DNA樣品準備到重組產物的轉化涂板培養的全部操作。
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產品特點

1.?無需考慮酶切位點限制，通過序列同源性15 min實現載體與片段的快速重組。
2.?插入片段的PCR產物正確且單，無需純化，可直接與載體進行重組反應。

產品簡介
EasyGeno單片段重組克隆試劑盒基于DNA序列同源性進行片段重組，可快速將單個片
段定向克隆到任意線性化載體中。通過精心設計和嚴格試驗，本試劑盒含有的2×EasyGeno
Single Assembly Mix具有的酶活性可將載體和片段的同源區域從雙鏈的3＇端進行重組連接，
終得到的無缺口閉環質?？芍苯愚D化感受態細胞篩選克隆。該方案克服了酶切位點的限
制，僅需在插入片段PCR引物5＇端引入線性化載體的末端序列，使得插入片段5＇和3＇兩端帶
有載體兩端的致性序列（15-25 bp），即可實現插入片段的定向重組進入載體。重組反應
可在恒溫條件下快速進行（50℃處理15 min），配合靈活的PCR產物處理方式和快速轉化方
法，數小時內即可完成從DNA樣品準備到重組產物的轉化涂板培養的全部操作。
產品特點
1. 無需考慮酶切位點限制，通過序列同源性15 min實現載體與片段的快速重組。
2. 插入片段的PCR產物正確且單，無需純化，可直接與載體進行重組反應。
3. 可以選擇性進行5 min快速轉化E.coli感受態細胞。
4) 向轉化體系中加入200 μl 無菌的SOC或LB培養基（不含抗生素）混勻?；靹蚝螅?/div>
200 μl已轉化的感受態細胞直接加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養基上，用無
菌的平板涂布玻璃珠（GB101）或涂布棒輕輕的將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至
液體被吸收，倒置平板，37℃培養6-9 h。
注意：對于氨芐青霉素抗性的載體，混勻后直接涂板。對于硫酸卡那霉素抗性或其他抗
性的載體，37℃搖床中180 rpm振蕩培養45-60 min后，吸取100-200 μl進行涂板。
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檢測
1. 常規檢測：將得到的菌落接種1-5 ml LB（含有相應濃度抗生素）培養基，37℃搖床振蕩
培養過夜，保存菌種后提取質粒，應用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
Control Insert DNA的PCR鑒定，請參考以下反應條件：
95℃ 2 min
94℃ 30 sec
55-65℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 1 kb/min
72℃ 5 min
4℃ ∞
注意：檢測引物的退火溫度基于引物自身序列而定，并建議使用載體引物進行檢測，
PCR延伸時間建議1 kb/min。
2. 快速檢測：挑取菌落直接進行PCR檢測（具體方法見分子克隆第三版）。
3. 測序鑒定：使用常規或快速方法進行初步的鑒定后進行序列的測定。
向感受態細胞懸液中加入5-10 μl重組產物（100 μl的感受態細胞能夠被1 ng超螺旋質粒
DNA所飽和），輕彈混勻，在冰浴中靜置30 min。
注意：所用DNA體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之。以下實驗以50 μl感受態
細胞為例。
3) 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 sec，然后快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3
min，該過程不要搖動離心管。
4) 向每個離心管中加入350 μl無菌的SOC或LB培養基(不含抗生素)， 混勻后置于37℃搖床
振蕩培養45 min（180 rpm），目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。
5) 將轉化體系混勻，吸取100 μl已轉化的感受態細胞加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊
脂培養基上，用無菌的平板涂布玻璃珠（GB101）或涂布棒輕輕的將細胞均勻涂開。將
平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養12-16 h。
注意：如若基于以往經驗克隆數較少，可將菌液4000 rpm離心10 min收集菌體，棄去培
養基，加入100-200 μl的SOC或LB培養基重懸菌體，并轉移至含相應抗生素的SOB或LB
固體瓊脂培養基上均勻涂開。
感受態菌落的生長速度取決于菌株的種類、所轉化質粒的種類及所攜帶的抗性基因。
(2) 快速轉化流程
1) 取T-Fast感受態細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管
中，置于冰浴中。
注意： 次轉化感受態細胞的建議用量為50-100 μl，可以根據實際情況分裝使用。
2) 待感受態完全融化以后，向感受態細胞懸液中加入5-10 μl重組產物（100 μl的感受態細胞
能夠被1 ng超螺旋質粒DNA所飽和），輕輕混勻，不要渦旋，并在冰浴中靜置2 min。
注意：所用DNA體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之。以下實驗以100 μl感受
態細胞為例。
3) 將轉化體系于42℃水浴中放置90 sec，然后快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2 min，
該過程不要搖動離心管。
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?注意事項 請務必在使用本試劑盒之閱讀此注意事項
1. 對于單個片段的PCR產物進行重組時，如果PCR條帶單，可以直接進行重組反應，加
入體積不要超過重組體系的20%，重組效率要低于使用純化后的PCR產物進行重組。
2. 如果想保留酶切位點進行后續的鑒定，建議增加缺失的酶切位點序列。
操作步驟
1. 線性化載體的制備
質粒的線性化不徹底將導致陰性克隆的產生，所以般建議通過雙酶切或PCR擴增的方
法進行質粒的線性化，然后通過膠回收的方法回收純化載體。對于以質粒模板進行擴增的
PCR產物，建議使用DpnⅠ內切酶消化殘存的質粒模板。
2. PCR產物的準備
PCR產物的擴增建議使用高保真性聚合酶，如Pfu DNA polymerase (EP101)，Ultra
HiFidelity PCR Kit (KP203)等。
（1）進行插入片段克隆的引物設計原則
線性化載體的末端可以是酶切得到的平末端（圖2a）、3’突出末端或5’突出末端（圖
2b），或者是PCR得到的平端類型（圖2a）。在引物設計時，遵循的原則是同源區域序
列的選擇與載體的3’末端序列對齊為準，例如，酶切位點產生得到5’突出末端，以另外
條鏈3’ 端得到的序列開始計算出15 nt的長度作為同源序列。正向引物為與載體左臂重疊
區域（15-25 nt）加上基因插入片段正向序列（22 nt左右），反向引物為與載體右臂重疊
區域（15-25 nt）加上基因插入片段反向序列（22 nt左右）。
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