DMB唾液酸釋放標記試劑盒-其它資料-資訊-生物在線

DMB唾液酸釋放標記試劑盒

作者：上海西寶生物科技有限公司 2019-07-16T00:00 (訪問量:9304)

LudgerTag DMB唾液酸釋放和標記試劑盒（貨號：LT-KDMB-A1）和包含試劑，用于從糖蛋白釋放唾液酸，通過胺環化反應釋放的唾液酸和DMB結合。
應用：用于從糖蛋白釋放唾液酸，再用DMB標記。
相對分子量 = 225.07 gmol-1
熒光 λex = 373 nm, λem = 448 nm.
結構
DMB的結構式
近義詞 DMB; 1,2-Diamino-4,5-methylenedioxybenzene Dihydrochloride; 1,3-Benzodioxole-5,6-diamine Dihydrochloride; 5,6-Diamino-1,3-benzodioxole Dihydrochloride
描述：該試劑盒和包含試劑，用于從糖蛋白釋放唾液酸，通過胺環化反應，經釋放的唾液酸和DMB結合。
樣品測試數：本試劑盒包含試劑和原料，可供最多22個樣品檢測用，包括唾液酸參照品、N-乙?；窠洶彼岷蚇-乙二醇神經氨酸定量標準品。
樣品量：通常每次可以分析50-200μg糖蛋白。我們建議分析樣品一式三份。
適合測試樣品：任何從糖蛋白、糖肽或聚糖釋放的唾液酸都可以標記。
儲存： 保存在 -18°C暗處。避免熱源，光照和潮濕。如妥善保存，試劑可以穩定至少2年。
運輸：該產品可以在室溫下運輸。
處置： 使用時涉及的玻璃或塑料器皿以及溶劑，應確保不含糖化酶及外源性碳水化合物。在所有樣品處理時，使用無粉末手套，避免受到外源性碳水化合物的污染。打開試劑瓶后，應立即使用。多余試劑根據當地安全規則丟棄。
安全：僅供研究用。不得用于人體或藥用。請閱讀安全數據表（SDS）了解所有涉及的化學品。進行標記試劑涉及的任何操作，都應使用適當的個人安全保護裝置 - 眼鏡、耐化學性手套（如 *類手套），以及在實驗室通風柜進行操作。
試劑盒組成
每個試劑盒包括以下試劑各1瓶：
LudgerTag DMB唾液酸釋放和標記試劑盒構成
Cat. # Item Quantity
LT-DMB-01 DMB染料 0.7 mg
LT-ACETIC2M-01 乙酸 2 Molar 2 x 1.1 mL
LT-MERCAPTO-01 巰基乙醇乙酸溶液 (1.4 Molar) 500 μL
LT-DITHIO-01
Sodium Dithionite(還原劑)
 4 mg
CM-NEUAC-01 N-乙?；窠洶彼岫繕藴势?/td> 1 nmol
CM-NEUGC-01 N-乙二醇基神經氨酸定量標準品 1 nmol
CM–SRP-01 唾液酸參照品，包括 Neu5Ac, Neu5Gc, Neu5,7Ac2, Neu5Gc, 9Ac, Neu5, 8Ac2, Neu5,9Ac2 and Neu5,x,xAc3 (此處x表示未知乙?；恢? 1.25 nmol
(總唾液酸)
所需的其他試劑和設備
  • 加熱模塊、爐或相近功能的干熱器，設定在80°C用于唾液酸釋放，設定在50°C用于唾液酸標記反應
  • 量程在1-1000 μL的移液器和吸頭
  • 真空離心機
  • 反應小瓶 (e.g. 0.5 mL聚丙烯瓶)
  • 分析級水 (eg. MilliQ)
  • 如需重復檢測，額外的唾液酸標準品【可選】：CM-NEUAC-01; CM-NEUGC-01
  • 陽性對照【推薦】：
    Ludger 胎球糖蛋白 GCP-FET-50U
    Ludger Bioquant糖肽 BQ-GPEP-A2G2S2-10U
?
標記操作的時間線
LudgerTag? 標記過程, 加上干燥時間和從分析樣品中酸解唾液酸，通常需要7個小時：
過程 時間
樣品制備 20分鐘?+ 干燥 (1-2 小時) *該操作可提前1天進行
唾液酸釋放 3 小時
DMB 標記 3.5 小時
總時間： 加上干燥7小時
方法
1 樣品制備
? 我們建議使用三等份試樣進行分析。高度唾液酸化的糖蛋白，取樣量50μg為宜；對于低唾液酸化樣品，如IgG等，取樣量提高至200μg。
? 請注意部分蛋白質常用的鹽/緩沖液可能對唾液酸分析產生干擾。這取決于樣品取樣量與緩沖液體積的比例(大量緩沖液會影響酸性水解時溶液的酸性)。根據我們的經驗，類似PBS等緩沖液，在樣品濃度高于1mg/mL,樣品取樣量在50-200 μg 之間，不會產生問題。
? 我們建議在樣品分析過程時，使用一系列的控制標品：
陽性過程控制糖蛋白：胎球糖蛋白: GCP-FET-50U
陽性過程定量控制糖肽: BQ-GPEP-A2G2S2-10U
陰性過程控制標品: 水
陰性過程控制標品: 樣品緩沖液
? 將等量的樣品和過程控制標品（除非已經干燥）置于0.5 mL聚丙烯小瓶中, 在真空離心機中干燥。
2 唾液酸釋放
? 設定爐溫80°C
? 往樣品和過程控制樣小品中加入25 μL 2 M乙酸溶液。
以下唾液酸標樣中不要加: 如使用Neu5Ac (CM-NEUAC-01), Neu5Gc (CM-NEUGC-01), Sialic acid 參照品 (CM-SRP-01) 小瓶 或 Neu5,9Ac2 (CM-NEU5,9,AC-01)。
? 旋渦溶解，然后短暫離心。
? 將樣品和對照品置于80°C的烘箱中，培養2小時（±5分鐘）。從烤箱中取出，冷卻至室溫。旋渦，然后短暫的離心。
? 從每個樣品或過程控制轉移5微升到0.5毫升的聚丙烯小瓶中，準備用DMB標記。如需要，經酸釋放的樣品可在-20°C下儲存至少2天[參考1]。
3 DMB標記
? 設定爐溫50°C.
? 添加440 μL巰基乙醇溶液（LT-MERCAPTO-01）到盛有Sodium Dithionite （LT-DITHIO-01）的小瓶中，使用移液器反復抽吸混合直至固體完全溶解。
? 將上述溶液完全轉移到盛有DMB 染料 （LT-DMB-01）的小瓶中，使用移液器反復抽吸混合直至染料完全溶解。
為保護標記試劑不受濕氣和曝光的影響，應在60分鐘內使用。 ? 將20 μL標記試劑加入每個樣品和過程控制樣中，蓋蓋，渦旋徹底混合并短暫離心，確保標記溶液位于瓶底部。
? 將20 μL標記試劑加入每個唾液酸標樣中(Neu5Ac, Neu5Gc, 唾液酸參照品, 加上 Neu5,9Ac2 ，如需), 蓋蓋，渦旋徹底混合并短暫離心，確保標記溶液位于瓶底部。
? 將樣品、控制樣和標準品置于50°C 爐中暗處培養3小時
在培養時，你可以著手調整LC的檢測條件用于接下來的分析 – 參見第4部分.
? 從爐中取出小瓶，加入以下試劑終止反應：
往每個樣品和控制樣中加入475 μL水
往每個唾液酸標準樣中加入480 μL水
4 LC分析
? 稀釋Neu5Ac和Neu5Gc標準品用于標準曲線制作 (使用表1作為指導, 通常Neu5Gc含量比Neu5Ac要低一些, Neu5Gc曲線范圍較Neu5Ac的要低一階)?；旌暇鶆颉?/div>
該項操作可以在液相色譜柱調節時進行。
?
Neu5Ac Std (μL)
Water (μL)
?
Neu5Gc Std (μL)
Water(μL)
1 in 1
200
0
?
-
-
1 in 2
100
100
?
100
100
1 in 5
40
160
?
40
160
1 in 10
20
180
?
20
180
1 in 50
10
490
?
10
490
1 in 100
10
990
?
10
990
1 in 1000
20 from 1 in 100 (premixed)
180
?
20 from 1 in 100 (premixed)
180
1 in 5000
-
-
?
10 from 1 in 50 (premixed)
990
表1. 標準品稀釋方案
? 將樣品1加水從1份稀釋到10份 (20 μL 樣品加180 μL水)。
? 將過程控制標準品用水稀釋10倍 (如使用Neu5,9Ac2，亦稀釋)。
? 不要稀釋 唾液酸參照品(SRP).
注：如果已知樣品的唾液酸化水平較低（如IgG），則不要用水稀釋。如果你發現液相色譜峰面積不在標準曲線范圍內，那么要么配置更濃的樣品，要么延長標準曲線。
樣品在10°C下避光的自動進樣器內可以至少保持穩定72小時【參考2】。
? 準備液相系統。應確保溶劑管路事先準備好。
溶劑 A = Sodium Dithionite :甲醇:水 9:7:84
溶劑 B = Sodium Dithionite
熒光: 激發波長: 373 nm; 發射波長: 448 nm
柱溫 = 30°C; 進樣溫度 = 10°C
時間(分鐘)
流速?mL/min
%A
%B
0
0.5
100
0
19
0.5
100
0
19.5
0.5
10
90
23.5
0.5
10
90
24
0.5
100
0
30
0.5
100
0
表 2. 使用LudgerSep-R1 柱(4.6 x 150 mm, 3 μm 顆粒) LS-R1-4.6x15030 進行30分鐘HPLC分析的操作方法。
進樣量 = 25 μL.
時間(分鐘)
流速?mL/min
%A
%B
0
0.25
100
0
7
0.25
100
0
7.5
0.25
10
90
8
0.25
10
90
8.5
0.25
100
0
15
0.25
100
0
表3. 使用LudgerSep-uR 柱(2.1 x 100 mm, 1.9 μm 顆粒) LS-UR2-2.1x100 進行15分鐘UHPLC分析的操作方法。
進樣量 = 5 μL.
? 使用適當的方法（按表2使用Ludgersep-R1柱進行高壓液相色譜分析，或按表3使用Ludgersep-UR2柱進行超高壓液相色譜分析）空進樣2到3次調節色譜柱。然后進一個系統空白水樣，檢查基線是否穩定。如果沒有，則繼續進水樣直到基線穩定，或在重新調整柱效前，使用10%A和90%B沖洗30分鐘。
? 接下來進2次以上SRP唾液酸參照品，直到譜圖重疊。 HPLC圖譜應類似于圖1，UHPLC圖譜則與圖2相近。不過，保留時間會因LC系統而異。
? LC系統現在可以進行樣本分析。我們建議按以下順序進樣（表4）：
SRP 唾液酸對照品
Neu5Gc 稀釋液，用于繪制標準曲線
Neu5Ac 稀釋液，用于繪制標準曲線
過程控制標準品 (胎球蛋白; GPEP; 水r; 緩沖液)
樣品
Neu5Gc 稀釋液，用于繪制標準曲線
Neu5Ac 稀釋液，用于繪制標準曲線
SRP 唾液酸對照品
表 4.進樣順序
5 驗收標準
? SRP與樣品組的圖譜在開始和結束應重疊，且偏移量最多在 ± 0.1 分鐘。
? 對于Neu5Gc和Neu5Ac，校正曲線的R2值>0.99。
?
? 遵循企業內部標準操作規范，Ludger對于胎球蛋白分析驗收標準為252 到377 nmol/mg 蛋白質 (例如 34 μg 胎球蛋白 50U酶活)
【參考3】。該驗收標準隨著更多GCP-FET-50U內部數據的收集，會進一步更新。在參考文獻3列明了驗收標準的歷史數據，并附有詳細的解釋。
? Ludger企業內部對于GPEP-A2G2S2分析驗收標準為5.6 到 8.4 nmol (由定量NMR測定 ± 20%)
DMB標記唾液酸參照品(CM-SRP-01)在LudgerSep-R1 HPLC柱跑出的液相圖譜
圖 1: DMB標記唾液酸參照品(CM-SRP-01)在LudgerSep-R1 HPLC柱跑出的液相圖譜。
峰: 1 = Neu5Gc; 2 = Neu5Ac; 3 = Neu5,7Ac2; 4 = Neu5Gc,9Ac; 5 = Neu5,8Ac2; 6 = Neu5,9Ac2; 7 = Neu5,x,xAc3 ( 此處x表示未知乙酰基位置); * = 試劑。
注:此圖譜僅作為示例。峰寬、分辨率和保留率與實驗室高效液相色譜系統有關。
DMB標記唾液酸參照品在LudgerSep-uR2 UHPLC柱跑出的液相圖譜
圖 2: DMB標記唾液酸參照品在LudgerSep-uR2 UHPLC柱跑出的液相圖譜。
峰: 1 = Neu5Gc; 2 = Neu5Ac; 3 = Neu5,7Ac2; 4 = Neu5Gc,9Ac; 5 = Neu5,8Ac2; 6 = Neu5,9Ac2; 7 = Neu5,x,xAc3 (此處x表示未知乙酰基位置); * = 試劑。
注:此圖譜僅作為示例。峰寬、分辨率和保留率與實驗室的超高效液相色譜UHPLC系統有關。
參考文獻及相關文獻
1. Ludger Document: S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0. Determination of the effect of freezing of DMB Labelled Sialic Acids.
2. Ludger Document: Fetuin Specifications for Sialic Acid Analysis-v2.0. Determination of Acceptance Criteria for Fetuin System Suitability Standard in Sialic Acid Analysis
3. Ludger Document: DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0. Validation of the DMB kit with Ludger Standards.
4. Ludger Document: Application note on ‘Quantitative Sialic Acid Analysis’ #APN002
反應機理
標記反應是一個兩步反應過程。
DMB標記反應機理
1.第一步是閉（環）形式唾液酸平衡到開環（非環）形式。
2.第二步系多步機制，其中DMB染料的伯胺與α-酮酸的羰基反應形成亞胺，該中間體與溶液中的還原劑反應，再與染料的其它伯胺反應。重排后生成帶熒光標記的唾液酸（二亞胺）。
故障排除
1.HPLC信號低
? 酸解不完整: 酸解時，我們推薦使用烘箱替代加熱元件。 部分加熱元件會導致樣品瓶中的酸蒸發和在瓶蓋處凝結從而導致酸解不完整。我們同時推薦在酸解時使用小型樣品瓶,體積不超過0.5 mL。
? 樣品中的鹽干擾標記：鹽和緩沖液會干擾唾液酸標記法。 如果你懷疑鹽對樣品產生干擾，分析前將樣品透析成無鹽溶劑。
2. 色譜圖中游離染料峰偏高
? 這可能是由于曝光過多導致的。請確認培養是在暗處避光操作的。一旦樣品標記后，最好立即送檢測HPLC以避免降解，樣品曝露在光和熱源時間增長會引起非唾液酸特征峰的增加。這也可能是由液相色譜長時間使用受污染導致，見下文。
? 在10度避光條件下，DMB標記的樣品可保存72小時，因此Neu5Ac和 Neu5Gc的數量很穩定,
前提是校準在相同條件下儲存并立即進行分析【參考文獻3】。如果這個難以實現的話，DMB標記樣品可以冷凍保存最多2天【參考文獻1】。
3.液相色譜峰保留時間波動；基線不穩定。
? 不正確的或舊的液相溶劑。始終以相同的方式制備溶劑（例如，通過將兩種溶劑混合在一起，使一種溶劑在量筒中達到一升，這與分別測量兩種溶劑并在瓶子中混合不同）。等比例梯度對溶劑制備的變化特別敏感。由于蒸發，溶劑成分會隨時間變化。
? 色譜柱被過量的游離染料/肽等污染，會導致保留時間偏移，譜圖上出現額外的峰。對于低唾液酸化水平的樣品來說，這個問題更大，因為大量的蛋白質被注射到色譜柱里。用常規洗脫溶劑和acetonitrile?10:90的混合物，以正常流速清洗柱子。
? 超高效液相色譜系統的運行條件尚未優化。評估您是否使用UHPLC的一個常見變量是“強/弱清洗”。這些對色譜法有顯著的影響。常規而言，“弱洗”使用最弱的梯度條件，“強洗”使用最強的梯度條件。您需要評估其中哪一種產生的SRP峰形與產品指南相一致。。我們建議開始線使用弱洗滌液進行液相色譜優化。
4.標記溶液中有析出
? 盡管非常罕見,在制備DMB標記溶液（Sodium Dithionite 、巰基乙醇和DMB混合物）仍有可能發生輕微的析出。我們曾觀察到此類現象，并檢測了該物質對標記效率的影響，并確定析出物不會影響標記反應。
5.唾液酸參照品 (SRP)在 (U)HPLC的圖譜與說明書不一致。
? 請確認該參照品未用酸處理。如用酸處理，SRP圖譜的僅包含Neu5Ac 和Neu5Gc相關的峰。
本產品僅供體外研究用。
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