?產品名稱】
通用名稱：豬圓環病毒II型檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Porcine Circovirus II?Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】?25?T/盒?＆ 50?T/盒
【預期用途】
豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）在分類學上屬圓環病毒科圓環病毒屬，為已知的最小的動物病毒之一。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測PCV?II型，對PCV?II型引起的豬的疫病的診斷和監控具有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對PCVII型基因組高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含PCVII型基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
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序號 |
組成 |
25?T/盒 |
50?T/盒 |
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1 |
PCV II?PCR反應液 |
?437.5 μL×1管 |
875 μL×1管 |
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2 |
PCV II?混合酶液 |
??62.5 μL×1管 |
125 μL×1管 |
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3 |
PCV II 陽性對照 |
????40 μL×1管 |
?40 μL×1管 |
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4 |
PCV II 陰性對照 |
????40 μL×1管 |
?40 μL×1管 |
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5 |
說明書 |
1份 |
1份 |
注：陰性對照為豬基因組DNA，陽性對照為PCV II經滅活處理的核酸提取物。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 新鮮采集的咽拭子、鼻拭子和糞便標本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。
2. 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-20℃～-80℃。
3. 標本保存期間應避免反復凍融。
【檢驗方法】
1.?試劑準備（試劑準備區）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
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單反液配制表(每份) |
PCR反應液 |
17.5 μL |
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混合酶液（Taq酶+UNG酶） |
?2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
(4)蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管和試劑盒中的DNA提取液轉移至樣本處理區。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準備（樣本處理區）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5?μl、終體積25?μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5?μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25?μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴增區）
（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。
?
?
?
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反應體積 |
25 μL |
通道選擇 |
FAM通道采集PCV II 熒光信號 |
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PCR 反應 條件 |
步驟 |
條件 |
循環數 |
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UNG處理 |
50℃：2分鐘（min） |
1 |
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預變性 |
95℃：3分鐘（min） |
1 |
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預擴增 |
95℃：5秒（s） |
5 |
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55℃：40秒（s） |
|||
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PCR擴增 |
95℃：5秒（s） |
40 |
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55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：