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二代測(cè)序是一個(gè)強(qiáng)大的功能平臺(tái)，它可以同時(shí)給數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA分子進(jìn)行測(cè)序。由于這種可以多個(gè)樣本同時(shí)測(cè)序的能力，在個(gè)性化醫(yī)療、遺傳疾病和臨床診斷等方面，二代測(cè)序也就是高通量測(cè)序開(kāi)創(chuàng)了革命性的領(lǐng)域。
早在1900年代就發(fā)明的Sanger測(cè)序法，成為了DNA測(cè)序的黃金法則，即便到了今天它仍被廣泛用來(lái)進(jìn)行常規(guī)測(cè)序和NGS數(shù)據(jù)的驗(yàn)證。它利用高保真DNA聚合酶生成與單鏈DNA模版互補(bǔ)的拷貝。在每個(gè)反應(yīng)中，一個(gè)可以特異性識(shí)別模版的單鏈引物，可以從3端開(kāi)始啟動(dòng)DNA合成，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，脫氧核糖核苷酸或簡(jiǎn)單的核苷酸是一個(gè)接一個(gè)的與模版配對(duì)。
每個(gè)反應(yīng)還包含四種雙脫氧核糖核苷酸的混合物，每一種對(duì)應(yīng)一個(gè)DNA堿基。這些雙脫氧核糖核苷酸與DNA單體十分類似，因此可以參與DNA鏈的增長(zhǎng)，但是他們和天然的脫氧核糖核苷酸有兩點(diǎn)不同：
(1)他們?nèi)鄙僖粋€(gè)會(huì)影響DNA鏈進(jìn)一步衍生的3’羥基。在DNA延伸過(guò)程中，這個(gè)3’羥基一旦加入DNA分子中就會(huì)導(dǎo)致鏈的終止;
(2)每個(gè)雙脫氧核糖核苷酸都有獨(dú)特的熒光染料吸附，使得DNA測(cè)序的自動(dòng)檢測(cè)得以進(jìn)行。
于是，每個(gè)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生許多不同長(zhǎng)度的DN**段，并在模版的任一核苷酸位置上由其中一種雙脫氧核糖核苷酸終止鏈的延伸。反應(yīng)混合物可以通過(guò)手動(dòng)灌膠或自動(dòng)灌膠到用毛細(xì)管進(jìn)入測(cè)序機(jī)器，再根據(jù)DNA分子大小不同用電泳分離DNA。當(dāng)DNA流過(guò)凝膠后，DNA序列可以通過(guò)雙脫氧核糖核苷酸上發(fā)出的熒光來(lái)進(jìn)行分析。當(dāng)今的Sanger測(cè)序儀使用的是毛細(xì)管自動(dòng)上樣的凝膠電泳，一般可以同時(shí)分析8-96個(gè)系列反應(yīng)。
二代測(cè)序系統(tǒng)在十年前就是因其可同時(shí)進(jìn)行大量平行測(cè)序反應(yīng)而廣為人知。這些系統(tǒng)可以同時(shí)分析百萬(wàn)甚至上億個(gè)序列反應(yīng)。雖然不同的機(jī)器生產(chǎn)時(shí)會(huì)在技術(shù)細(xì)節(jié)上有許多不同，但他們都有以下幾個(gè)共同點(diǎn)：
1,文庫(kù)建立：所有二代測(cè)序的平臺(tái)都需要一個(gè)基因文庫(kù)，這個(gè)基因文庫(kù)包含通過(guò)引申或者連接自定義的接頭序列。
2,測(cè)序儀器：每個(gè)文庫(kù)片段在共階吸附的DNA連接因子的作用下，以文庫(kù)適配序列為模版，在固體表面上進(jìn)行擴(kuò)增。這步擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生許多DNA蔟，每個(gè)來(lái)源于一個(gè)文庫(kù)片段，每個(gè)基因蔟都會(huì)像獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)一樣起作用。
3,數(shù)據(jù)輸出：每個(gè)儀器都會(huì)在測(cè)序結(jié)束后給出原始數(shù)據(jù)。這個(gè)原始數(shù)據(jù)時(shí)每個(gè)基因蔟中形成的DNA序列的集合。
不同的二代測(cè)序平臺(tái)的區(qū)別主要體現(xiàn)在測(cè)序反應(yīng)的技術(shù)上，這些差別可以分為4類：
焦磷酸測(cè)序，合成法測(cè)序，連接法測(cè)序和離子半導(dǎo)體測(cè)序。
焦磷酸測(cè)序
在焦磷酸測(cè)序中，測(cè)序反應(yīng)通過(guò)每個(gè)核苷酸結(jié)合過(guò)程中釋放的焦磷酸來(lái)調(diào)控。釋放的焦磷酸參與了一系列化學(xué)反應(yīng)從而導(dǎo)致鏈光的產(chǎn)生。發(fā)出的光由記錄基因蔟相應(yīng)序列的相機(jī)來(lái)檢測(cè)。測(cè)序反應(yīng)開(kāi)始后，先一次孵育一個(gè)堿基，測(cè)量光發(fā)射情況(如果有的話)，在降解未參與反應(yīng)的堿基，最后加入另一個(gè)堿基。這項(xiàng)技術(shù)能夠產(chǎn)生較大的讀取長(zhǎng)度，已經(jīng)可以與Sanger測(cè)序法得到的讀取長(zhǎng)度相比較。然而，高昂的試劑花費(fèi)，和有6個(gè)或以上的均聚物會(huì)產(chǎn)生的高錯(cuò)誤率阻礙了這個(gè)技術(shù)的應(yīng)用。
合成法測(cè)序
合成測(cè)序法是使用可逆熒光和終止核苷酸的分步整合的方法進(jìn)行DNA測(cè)序，并已被ll lumina NGS平臺(tái)使用。首先在測(cè)序芯片中同時(shí)加入四種核苷酸，核苷酸結(jié)合之后，剩余的DNA堿基就會(huì)被洗滌去除。每個(gè)基因蔟中熒光信號(hào)被讀取和記錄之后，這個(gè)過(guò)程一直重復(fù)直到測(cè)序反應(yīng)完成。這個(gè)系統(tǒng)能通過(guò)一次只結(jié)合一個(gè)核苷酸來(lái)克服焦磷酸測(cè)序的缺點(diǎn)。然而，當(dāng)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，儀器的錯(cuò)誤率也在增加。這是因?yàn)槿コ煌耆臒晒庑盘?hào)會(huì)導(dǎo)致更高的背景噪聲。
連接測(cè)序法
連接測(cè)序法與其他兩種方法不同，因?yàn)樗挥肈NA聚合酶來(lái)結(jié)合核苷酸，而是用16種8-mer Oligo核苷酸探針，在相互連接的5端，每個(gè)探針都吸附了四種熒光染料其中的一種。每8-mer包含兩個(gè)探針特異堿基，和6個(gè)退化堿基。測(cè)序反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，引物先結(jié)合到適配序列上，再和相應(yīng)探針結(jié)合。這個(gè)探針的結(jié)合時(shí)在退火條件下由兩個(gè)探針特異堿基引導(dǎo)，再由DNA連接酶連接到引物序列上。未結(jié)合的oligo核苷酸被洗去后，熒光信號(hào)就開(kāi)始檢測(cè)會(huì)記錄。在這之后，切割掉熒光信號(hào)和8-mer探針的最后3個(gè)堿基，就可以開(kāi)始下一個(gè)循環(huán)了。在大約7個(gè)循環(huán)的連接之后，DNA會(huì)變性，而另一個(gè)測(cè)序引物，在前一個(gè)引物的下一個(gè)堿基后開(kāi)始重復(fù)這些步驟，總共用5個(gè)測(cè)序引物。這項(xiàng)技術(shù)的主要缺點(diǎn)就是產(chǎn)生的測(cè)序片段特別短。
離子半導(dǎo)體測(cè)序
離子半導(dǎo)體測(cè)序法時(shí)在測(cè)序反應(yīng)種通過(guò)釋放氫離子來(lái)檢測(cè)一個(gè)基因蔟的序列。每個(gè)基因蔟直接定位在一個(gè)半導(dǎo)體三極管上，這個(gè)半導(dǎo)體三極管可以檢測(cè)溶液的ph值。在核苷酸結(jié)合過(guò)程中，一個(gè)氫離子被釋放到溶液中并會(huì)被半導(dǎo)體三極管檢測(cè)到。這個(gè)測(cè)序反應(yīng)的進(jìn)行過(guò)程和焦磷酸法類似，但是花費(fèi)只是他的幾分之一。