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Caspase-3活性測定試劑盒

品牌：Solarbio | 貨號：BC3830

保存：試劑常溫運輸，到達后按要求儲存，1 年內穩定。

產品內容： （所示為 100T，50T 檢測試劑量減半）

1. 裂解緩沖液? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?20 ml, 4 oC

2. 反應緩沖液? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?10 ml, 4 oC

3. 2 mM DEVD-pNA 底物? ? ? ? ? ? ? ?0. 5 ml, -20 oC 避光?

4. 10 mM pNA 標準品? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.2ml, -20 oC 避光

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產品介紹： Caspase-3 是 凋 亡 過 程 中 最 主 要 的 終 末 蛋 白 酶 ， 也 是 研 究 最 多 的 caspase ； 它 激 活 pro-caspase-2,6,7,9，特異水解多種關鍵凋亡蛋白如 PARP，介導染色質固縮、凋亡小體生成、核 DNA 斷裂。測定原理基于 Caspase-3 特異水解多肽底物 DEVD-pNA (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide)，釋 放的游離**苯胺 pNA 在 405 nm 有最大吸光度。采用可見光光度比色法測定 pNA 而得到 Caspase 活性。適用于檢測哺乳動物組織、細胞 Caspase-3 活性。

所需儀器： 可見光分光光度計配 100μl 比色杯，或酶標儀。最佳波長 405 nm，也可測 OD400~450 nm 但靈 敏度略降。

操作步驟：

一、組織細胞準備：

Caspase活性測定值低，最常見原因是未發生凋亡或細胞量太少，其次是觀測時間點不恰當。 誘導凋亡時，并非劑量越大時間越長Caspase活性就越高?？稍O置不同劑量和時間點如0、2、4、8、 16、24小時，以檢測最佳的觀察點。通常2×10 7細胞或2mg組織裂解于1ml可產生1~3mg/ml蛋白。初 次測定時，單個測定反應可加~200μg蛋白物對應于2×10 6細胞或2個孔的6孔板細胞。最少，單個測定 反應需加20μg蛋白對應于2×10 5個細胞或2個孔的12孔板細胞。勿用絲氨酸蛋白酶抑制劑如E-64和 leupeptin以免抑制Caspase活性。

1、（1）細胞裂解：1000g 5分鐘收集細胞，吸盡上清。每2~10×10 6細胞加50~100μl裂解液震蕩裂解， 冰浴10分鐘，再次震蕩。

(2) 組織裂解：3~10mg組織加100 μl裂解液放入小型玻璃勻漿器，上下勻漿30次。轉移勻漿液于離 心管。

2、4 oC 12,000g 10分鐘，取上清測定，或-70 oC保存。

3、蛋白定量：用Bradford法測定蛋白濃度。裂解液含還原劑不宜采用BCA法。應使蛋白濃度達到1-3 mg/ml，相當于每10 μl待測樣品含10-30μg蛋白，否則應增加細胞用量。

二、測定pNA標準曲線：

1.用反應緩沖液稀釋 10mM pNA 標準品為 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。設置不加 pNA 的 零管。

2.每一濃度取 100 μl 加入 96 孔板或 100μl 比色杯，測定 405nm 吸光度 OD 值。

3.每一濃度標準管 OD405 值為 x 軸，對應的 pNA 濃度為 y 軸，用 Excel 制作 pNA 濃度對 OD405 值的標準曲線。

三、樣品測定操作：

1.按下表設置 96 孔板反應體系。底物最后加入以使各管反應起始時間相同。設置不加樣品的空白對 照管。酶活力不足或過高，可增加或減少樣品。

2.蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC反應2小時，肉眼可見顏色變黃時的OD405值約為0.2，此 時即可測定。顏色變化不明顯可延長反應或過夜，但酶活性較強時，孵育時間過長將導致反應失 去線性關系。

3.樣品管OD405減去空白對照OD405，為樣品Caspase水解底物產生的pNA吸光度。根據標準曲線計 算其含量，并以蛋白濃度校正之。

4.測得的Caspase酶活性表示方法有兩種。

(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 實驗處理組OD / 實驗對照組OD，簡單而可靠。

(2) 樣品Caspase酶活力單位/mg protein，精確但計算較復雜，參見說明。

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產品說明：

1.Caspase酶活力單位定義：參考Chemicon公司One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 oC under saturated substrate concentrations。即當 底物飽和時,一個Caspase酶活力單位定義為37 oC 1小時水解pNA底物，產生1nmol游離pNA。根據 pNA標準曲線和樣品OD值，可計算出Caspase酶活力單位。

2. 除了處理組外，可設置陽性凋亡誘導劑組，陰性實驗對照可包括不具有凋亡誘導作用的試劑(如 果能得到)處理組、溶劑對照組、或凋亡誘導零時間點。

參考文獻：

1. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J. 326, 1-16 (1997).

2. Porter AG and Janicke RU. Emerging role of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ. 6, 99-104 (1999).