南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科殷詠梅副院長團(tuán)隊成員與西北大學(xué)芬伯格醫(yī)學(xué)院羅伯特·盧里綜合癌癥中心的研究者剛剛在《Science Advances》雜志（影響因子：14.957）上發(fā)表了一篇題為“Proteolytic Regulation of CD73 Orchestrates Tumor Immunogenicity”（調(diào)控CD73的蛋白水解可調(diào)節(jié)腫瘤免疫原性）的論文給出了新的腫瘤治療思路。文章提到，乳腺癌是導(dǎo)致婦女癌癥死亡的第二大原因，對于女性的健康造成很大的威脅。其中三陰性乳腺癌（TNBC）被認(rèn)為是一種“冷腫瘤”，對其治療選擇較少，也是最具侵襲性的乳腺癌形式，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。在乳腺癌治療靶點(diǎn)的選擇上，除了免疫檢查點(diǎn)外，還存在CD73這類與腫瘤微環(huán)境免疫功能相關(guān)的蛋白。高水平的CD73與較差的預(yù)后相對應(yīng)。與此同時，三結(jié)構(gòu)域（TRIM）蛋白也與免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生有關(guān)。TRIM蛋白本質(zhì)上是蛋白質(zhì)降解途徑的一部分，在其中它們發(fā)出某些蛋白質(zhì)的降解信號。先前的研究表明，TRIM21水平與疾病進(jìn)展相對應(yīng)，但迄今為止，它與癌癥免疫原性的關(guān)聯(lián)仍不清楚。

研究思路

研究者證實(shí)了CD73的高表達(dá)與所有乳腺癌分類中較低的生存率相關(guān)。然后，他們通過一些分子生物學(xué)技術(shù)揭示了CD73水平經(jīng)歷了一種被稱為泛素化的翻譯后修飾。泛素化本質(zhì)上是蛋白質(zhì)的一種降解信號。通過分子生物學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合發(fā)現(xiàn)這種蛋白水解信號的驅(qū)動因素是TRIM21。接下來，鑒定TRIM21作為控制CD73蛋白降解以調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的潛在泛素E3連接酶。

泛素化的關(guān)鍵是泛素肽附著（或連接）到賴氨酸殘基上。該小組試圖找出哪些賴氨酸殘基可能是CD73蛋白被泛素化的賴氨酸。他們鑒定了以下賴氨酸作為泛素化位點(diǎn)：K133、K208、K262和K321。為了確定這些賴氨酸對TRIM21介導(dǎo)的CD73降解的重要性，作者將這些特定殘基突變?yōu)榫彼幔碚撋蠒钄喾核鼗玫蕉鄠€突變TNBC細(xì)胞系：MDA-MB468-CD734KR（這4個賴氨酸殘基均突變?yōu)榫彼幔琈DA-MB468-CD73K133R/K208R（K133和K208的賴氨酸突變?yōu)榫彼幔琈DA-MB468-CD73K262R/K321R（賴氨酸K262和K321突變?yōu)榫彼幔?/p>

IsoPlexis檢測方法

將MDA-MB468-CD73WT或MDA-MB468-CD734KR分別用APCP（CD73抑制劑）或不加APCP處理24小時，使用腫瘤條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集突變TNBC細(xì)胞培養(yǎng)上清液。供體PBMCs加入收集的上清液，使用anti-CD3刺激，培養(yǎng)WT/No APCP、4KR/No APCP、WT/APCP或4KR/APCP四組細(xì)胞。在孵育72小時后，作者評估了供體PBMC分選的CD8+T細(xì)胞的多功能性和細(xì)胞多功能指數(shù)PSI。

研究者發(fā)現(xiàn)，與WT細(xì)胞的T細(xì)胞相比，加入突變細(xì)胞系培養(yǎng)上清的T細(xì)胞多功能和多功能指數(shù)總體耗盡。并且有趣的是，與未經(jīng)APCP處理的T細(xì)胞相比，經(jīng)APCP處理的T細(xì)胞的多功能性和PSI似乎略有增加（圖2）。

這意味著靶向CD73，通過增強(qiáng)其降解或簡單抑制其功能可能是增強(qiáng)免疫功能的可行選擇。他們也進(jìn)行了進(jìn)一步檢測以明確起關(guān)鍵作用的泛素化位點(diǎn)，培養(yǎng)MDA-MB468-CD73K133R/K208R和MDA-MB468-CD73K262R/K321R（圖3），評估其培養(yǎng)上清對于CD8+T細(xì)胞多功能和PSI的影響，結(jié)果顯示，K262和K321突變組的細(xì)胞多功能性和PSI均顯著降低，表明K262和K321是TRIM21介導(dǎo)CD73泛素化降解的關(guān)鍵賴氨酸位點(diǎn)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用IFN?處理MDA-MB468細(xì)胞時，TRIM21水平顯著升高，CD73水平顯著降低。這表明，像CD8+T細(xì)胞這樣的IFN?分泌細(xì)胞的存在創(chuàng)造了一個反饋回路，從而提高腫瘤細(xì)胞中的TRIM21水平，進(jìn)而耗盡CD73水平。最后，本文總結(jié)了小鼠和患者的體內(nèi)數(shù)據(jù)，探討了TRIM21水平如何與小鼠模型腫瘤負(fù)荷和患者更有利的免疫信號相關(guān)。總之，作者闡明了CD73如何促進(jìn)TNBC的免疫逃避的機(jī)制，同時也揭示了CD73可以通過TRIM21進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制。最終，這些數(shù)據(jù)為靶向CD73以提高免疫療法和其他類型的治療方法的有效性提供了一個案例。

文章點(diǎn)評

#1

在免疫檢查點(diǎn)治療策略之外，對付癌癥的“武器庫”永遠(yuǎn)需要新的選項，評估這些選項的標(biāo)準(zhǔn)是什么？是用了很多年的檢測方式，還是研究人員比較“熟悉”的一些諸如濃度、成像、亞群等指標(biāo)，抑或是“其他人”也在做的實(shí)驗方法。我們認(rèn)為答案是否定的，需要用事實(shí)說話，臨床轉(zhuǎn)化研究中的事實(shí)就是能否與臨床結(jié)果建立相關(guān)性，這也是單細(xì)胞蛋白組技術(shù)對于臨床轉(zhuǎn)化及前期基礎(chǔ)研究的意義。

#2

IsoPlexis平臺提供了評估免疫功能的標(biāo)準(zhǔn)，從而更好地確定治療策略是否有效，如為CD73等新靶點(diǎn)評估提供決定性的根據(jù)。

#3

與免疫檢查點(diǎn)和細(xì)胞治療不同，新的泛素依賴的藥物研發(fā)路徑使之前“難以成藥”的蛋白成為新的靶點(diǎn)。要評估蛋白對于免疫微環(huán)境的影響，需要去檢測免疫細(xì)胞的免疫功能的變化，需要對于活的免疫細(xì)胞進(jìn)行刺激，并且避免由于免疫細(xì)胞的功能異質(zhì)性而隱藏的重要信息，所以需要使用單細(xì)胞層面的功能蛋白組檢測，這使得單細(xì)胞功能蛋白組技術(shù)成為這類研究的不二之選！