?高通量RNA干擾技術篩選DNA損傷- ImageXpress
目前，將RNAi庫和基于細胞水平的高通量分析技術相結合對于我們鑒定藥物敏感性和抵抗性的新機制有非常廣闊的前景。舉例來說，已有研究者對全基因組進行RNAi篩選找出了導致非小細胞肺癌對紫杉醇敏感的基因。這項研究也證實了RNAi技術在發現影響癌癥細胞細胞有絲分裂的靶點上具有很大潛力。
Molecular Devices公司開發了一款非常強力的篩選平臺—ImageXpress系統。該系統擁有完整的圖像獲取及分析模塊，可以快速生成想要的數據。
本文我們列舉了如何通過對磷酸化的組蛋白H2AX和DNA進行免疫熒光雙色分析方法來檢測DNA損傷。組蛋白H2AX在絲氨酸139位點的磷酸化被認為是藥物或輻射造成的DNA損傷的敏感標記。文中也闡明了我們利用RNAi對雙色標定DNA損傷分析是一個敏感和快速的自動化過程，而且這種方法被證明可以有效發現新的目標。圖1列舉了這種分析的設置方法。
圖1 通過標記磷酸化組蛋白H2AX檢測DNA損傷的示意圖
實驗步驟
細胞及其培養條件。用加入10%FCS的DMEM培養HeLa細胞。細胞移入384孔避光且底面光潔的聚苯乙烯板(Greiner)中，密度為每孔約600個細胞。
利用ImageXpress系統檢測DNA損傷。在經過RNAi及/或DNA損傷處理后，細胞固定，打孔并用相應抗體直接免疫染色組蛋白H2AX的絲氨酸139的磷酸化位點。所用二抗為抗兔Alexa Fluor-488(AF-488，Invitrogen)，propidium iodide(PI)標記所有的細胞核。ImageXpress激光掃描平臺設置為綠色濾光通道(Ch1,510-540nmBP)及紅色濾光通道(Ch3,600nm LP)。利用紅色通道的逐區掃描可以對全板孔圖像進行分析，背景則由整合了綠色及紅色通道的熒光強度進行調整和修正。在圖2中我們列舉了陽性和陰性樣本的圖像。
圖2 利用ImageXpress系統對DNA損傷實驗的陰性和陽性孔進行整空成像，細胞生長于384孔板，左側為綠色通道，右側為紅色通道。
結果及討論
我們整合了ImageXpress 系統和機械加樣臂對超過20000個RNAi進行篩選（數據庫由斯坦福大學Karlene Cimprich 實驗室提供）。我們的平臺可以通過雙色圖像處理技術同時自動化處理圖像以及定量分析細胞的DNA損傷狀況。
圖3 陰性(上)和陽性(下)細胞分析結果的散點圖如圖所示。紅色的斜線為Ch3/Ch1，表示DNA損傷的閾值。陰性損傷比率為1.9%，陽性的比率為88.5%。
圖4 展示了按照384孔板布局排布的RNAi篩選DNA損傷的百分比結果。陰性對照空(8個)標記為灰色，陽性對照孔(8個)標記為綠色。Z’值為0.9，其他RNAi處理孔的損傷率為13.5%，標記為橙色。
圖2中列舉的用磷酸化H2AX和PI染色細胞作為陰性和陽性對照，我們在圖3中展示了其雙參數點陣圖結果。紫色分割線代表Ch3/Ch1的比率，其X軸截距可調節，而這一比率定義了自動化DNA損傷定量檢測的標準。其中陰性對照樣本的比率為1.9%而陽性對照樣本(已經用RNAi技術處理過增加了DNA損傷幾率)的比率為88.5%。
圖4中我們列舉了具有代表性的384孔細胞的DNA損傷百分率。陰性對照孔(n=8)用灰色表示，陽性對照孔(n=8)用綠色表示。Z’-prime值為0.9。其余用RNAi處理的和比率大于等于13.5%的孔則用橙色表示。
結論
H2AX的磷酸化已經被證實是檢測離子照射和藥物所致DNA雙螺旋損傷的早期敏感標志。本文我們展示的ImageXpress激光掃描平臺可以通過雙色檢測對DNA損傷進行定量。我們也闡述了這種雙色DNA損傷檢測具有高速，自動化，靈敏的特點。通過設計好的RNAi，我們可以篩選誘導腫瘤細胞致DNA損傷的目的基因。此平臺獨特的光學和掃描工具可以實現簡單的“插入電源然后工作”的操作，這也同時滿足了學術和工業領域生命科學研究者們的需求。