癌癥耐藥性是癌癥治療中的一個(gè)重大挑戰(zhàn)，導(dǎo)致療效不佳或治療后復(fù)發(fā)。當(dāng)前，研究人員利用前沿技術(shù)加深對(duì)腫瘤耐藥機(jī)制的了解，嘗試開發(fā)出可繞過腫瘤耐藥機(jī)制的個(gè)體化聯(lián)合療法。
其中，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)可在單細(xì)胞的分辨率上檢測(cè)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)的多重磷酸化蛋白，了解異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的整個(gè)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，及其在藥物作用下的變化，從而加速發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥機(jī)制，為設(shè)計(jì)新型有效的腫瘤聯(lián)合療法及新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)提供新的見解和指導(dǎo)。
圖示腫瘤耐藥發(fā)展路徑
在阻斷腫瘤的主要信號(hào)通路后，可能有部分腫瘤細(xì)胞通過其他信號(hào)旁路繼續(xù)維持存活或增殖，導(dǎo)致耐藥發(fā)生
來(lái)自加州理工學(xué)院David Baltimore課題組、西雅圖系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院James R. Heath課題組和蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所的Guideng Li課題組，在Nat Communications(IF: 14.919)上發(fā)表的一篇名為“Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line”的文章，闡述如何利用單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)研究腫瘤的耐藥性發(fā)展，以及如何尋找新的潛在治療靶點(diǎn)。
文章摘要
通過高維空間細(xì)胞狀態(tài)確定單個(gè)細(xì)胞的軌跡，對(duì)于理解從細(xì)胞分化到藥物處理后的疾病細(xì)胞表觀遺傳學(xué)反應(yīng)等生物學(xué)變化是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。該研究通過理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，確定了BRAFV600E突變的單個(gè)黑色素瘤細(xì)胞從藥物敏感到藥物耐受狀態(tài)之間的發(fā)展軌跡。盡管單細(xì)胞組學(xué)工具可以幫助生成某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞狀態(tài)圖譜，但確定單個(gè)細(xì)胞的空間軌跡可能會(huì)被隨機(jī)的細(xì)胞狀態(tài)切換所混淆。
研究人員在藥物處理后5天時(shí)間內(nèi)分析了腫瘤細(xì)胞的一系列信號(hào)通路、細(xì)胞表型和代謝調(diào)節(jié)因子，揭示了在藥物敏感和藥物耐受狀態(tài)之間的兩條路徑的細(xì)胞狀態(tài)變化。特定細(xì)胞的發(fā)展軌跡取決于譜系限制性轉(zhuǎn)錄因子的藥物反應(yīng)水平。每條軌跡都顯示出獨(dú)特的藥物敏感性，揭示了同基因細(xì)胞群體中適應(yīng)性耐藥發(fā)展的新模式。
研究思路
建立BRAFi誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞耐藥模型
建立BRAFi誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞耐藥模型
?
通過單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)檢測(cè)耐藥發(fā)展中各種蛋白和代謝物的變化
降維分析顯示腫瘤耐藥發(fā)展的不同軌跡
通過臨界點(diǎn)分析確定軌跡分叉的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，即潛在治療靶標(biāo)
?
研究結(jié)果
1
通過單細(xì)胞蛋白組和代謝組分析揭示黑素瘤細(xì)胞耐藥途徑
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研究人員利用病人來(lái)源的BRAFV600E突變黑素瘤細(xì)胞系(M397)，建立了靶向抑制劑誘導(dǎo)的快速藥物耐受模型。在BRAF抑制劑(BRAFi)作用下，這些高度可塑性細(xì)胞從初始的藥物敏感狀態(tài)轉(zhuǎn)變成后期耐藥狀態(tài)（圖1a），研究人員通過單細(xì)胞條形碼芯片(SCBC)進(jìn)行功能蛋白質(zhì)組和代謝物分析，研究這一過程中相關(guān)的表型標(biāo)志物和致癌信號(hào)標(biāo)志物、腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和代謝活動(dòng)等，洞察腫瘤耐藥產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制。
圖1. 黑素瘤M397細(xì)胞在BRAFi處理不同天數(shù)后采用IsoPlexis單細(xì)胞蛋白組和代謝組芯片進(jìn)行分析
在BRAFi處理后0、1、3、5天，M397細(xì)胞通過SCBC中成千上萬(wàn)個(gè)微室分離單細(xì)胞，然后對(duì)每個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行原位裂解，釋放其胞內(nèi)組分。每個(gè)微室含有全套條形碼陣列，通過捕獲抗體或分子探針與特定靶蛋白或代謝物結(jié)合（圖1a）。
研究結(jié)果顯示（圖1b）
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BRAFi 處理后 |
M397黑色素瘤細(xì)胞的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組 和代謝組變化 |
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D0 |
· 許多分析標(biāo)志物的基線水平表現(xiàn)為廣泛異質(zhì)性，如Ki67的異質(zhì)性表達(dá)提示細(xì)胞群體中既有快速分裂，也有緩慢分裂的細(xì)胞。 ? · 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的高度攝取、代謝酶乳酸脫氫酶（LDH）和PKM2的表達(dá)一致。 |
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D1 |
· 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入及大多數(shù)代謝調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路以及Ki67表達(dá)受到抑制，表明BRAFi治療有效的阻斷了相關(guān)的致癌信號(hào)通路。 ? · 仍有一小群細(xì)胞Ki67水平較高，表明藥物反應(yīng)遲緩。 |
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D3 |
· 短暫的細(xì)胞分化，隨即去分化，表現(xiàn)為MART1表達(dá)先升高（D3）后降低（D5）。 ? · 許多分析物急劇升高，在D5下降，包括代謝酶（p-LKB除外）、所有耐藥狀態(tài)標(biāo)志物及調(diào)節(jié)因子（Slug除外），所有代謝酶，所有信號(hào)通路磷酸化蛋白，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換可能發(fā)生在D3這個(gè)時(shí)間點(diǎn)。 |
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D5 |
· 葡萄糖攝取恢復(fù)到接近D0水平，但異質(zhì)性升高。 ? · Ki67進(jìn)一步降低，異質(zhì)性相比D0急劇降低。 ? · 大部分細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)，但凋亡細(xì)胞死亡率未顯著升高。 ? · 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug的變異和豐度增加，表明一些細(xì)胞傾向于向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化。 ? · 藥物抗性有關(guān)因子，如AXL、N-cadherin、NGFR和TNFR水平有所提高。 ? *以上提示，M397細(xì)胞在D5已開始產(chǎn)生了耐藥。 |
因此，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組的聯(lián)合分析，提供了證據(jù)表明D1初始藥物反應(yīng)、D3藥物誘導(dǎo)細(xì)胞狀態(tài)變化、D5出現(xiàn)藥物耐受，有助于早期發(fā)現(xiàn)藥物抵抗，而無(wú)需等到數(shù)周后出現(xiàn)細(xì)胞增殖才能判斷耐藥。
2
降維分析提示多種細(xì)胞發(fā)展軌跡
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通過降維分析顯示藥物處理后單細(xì)胞多標(biāo)志物隨時(shí)間的協(xié)調(diào)變化。FLOW-MAP分析顯示，M397黑色素瘤細(xì)胞隨著藥物處理時(shí)間延長(zhǎng)，呈現(xiàn)不同的群體聚集特點(diǎn)及演變軌跡：
在BRAFi處理前(d0)
大多數(shù)M397細(xì)胞表達(dá)蛋白水平均一，部分蛋白表達(dá)水平差異較大，如N-cadherin、MITF、HIF1α、Ki67和MART1。
一小部分細(xì)胞表達(dá)低水平的Ki67、MITF和MART1（圖2中MITF、MART1和Ki67方框中的虛線部分），提示這是一群去分化、分裂緩慢的細(xì)胞。
在BRAFi處理后，細(xì)胞群體最初分裂為兩群，分布在FLOW-MAP圖的兩個(gè)區(qū)域。
在d1，大多數(shù)細(xì)胞聚集在d0細(xì)胞的右上方，而小部分亞群直接聚集在d0組的右側(cè)。
這種趨勢(shì)在d3處繼續(xù)，大多數(shù)細(xì)胞聚集在d1上方，而少數(shù)細(xì)胞聚集在d1一小群細(xì)胞的右側(cè)。
到d5時(shí)，所有細(xì)胞都聚集到圖形的右方。
在d1和d3細(xì)胞分叉狀態(tài)意味著細(xì)胞耐藥朝上、下兩種軌跡發(fā)展的可能性。
因此，對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的計(jì)算分析表明，在BRAFi適應(yīng)的早期階段出現(xiàn)了兩種不同的藥物反應(yīng)軌跡。
圖2. 單細(xì)胞蛋白組和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果
3
Surprisal分析揭示兩條不同的耐藥發(fā)展軌跡
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采用Surprisal分析單細(xì)胞數(shù)據(jù)，鑒定了兩種主要的耐藥發(fā)展模式：模式1和2（圖3a）。這兩個(gè)模式中所有的檢測(cè)分析物的預(yù)測(cè)性表達(dá)與單細(xì)胞檢測(cè)數(shù)據(jù)非常匹配，表明這兩個(gè)模式重現(xiàn)了細(xì)胞在為期5天的藥物處理過程中的所有分子特征的總體變化。每個(gè)模式的評(píng)分表示模式相關(guān)分析物在細(xì)胞中富集或抑制的程度，并將得分進(jìn)行顏色編碼對(duì)應(yīng)到相應(yīng)的分層圖上（圖3a）。
模式1的評(píng)分在上下兩條路徑上都從負(fù)值（藍(lán)色）逐漸增加到正值（紅色），并且在中間時(shí)間點(diǎn)有清楚的變化，表明在軌跡過渡中存在一個(gè)生物物理屏障（圖3a），意味著細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變及不同細(xì)胞狀態(tài)之間的界限。考慮到模式1評(píng)分與Ki67表達(dá)負(fù)相關(guān)，與NGFR/AXL表達(dá)正相關(guān)，模式1評(píng)分隨時(shí)間的變化似乎可以反映d1到d3期間從藥物敏感狀態(tài)到藥物耐受狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。
模式2也展現(xiàn)出類似的變化。值得注意的是，黑素瘤細(xì)胞表型轉(zhuǎn)錄因子MITF及其下游蛋白MART1的表達(dá)均與模式2評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（圖3b），提示兩條路徑的分叉可能與上述兩種蛋白密切關(guān)聯(lián)。
圖3. Surprisal分析顯示耐藥發(fā)展的兩種模式
Surprisal分析為細(xì)胞從藥物敏感狀態(tài)轉(zhuǎn)變成耐藥狀態(tài)的上下兩條路徑提供了理論支持。研究人員后續(xù)通過一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證。根據(jù)模式2，未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞(D0)含有兩種狀態(tài)的細(xì)胞，可通過MITF和MART1的表達(dá)加以區(qū)分，其中MITF-Low細(xì)胞在藥物處理后可能通過下面的路徑轉(zhuǎn)變，而MITF-High細(xì)胞則通過上面的路徑發(fā)展。通過MITF-GFP報(bào)告基因細(xì)胞系分選出GFP高表達(dá)(MITF-high)和低表達(dá)(MITF-Low)的細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)MITF-high細(xì)胞表達(dá)更高水平的Ki67和MITF以及更短的倍增時(shí)間，說(shuō)明細(xì)胞表型從黑色素瘤系、高度增殖的狀態(tài)轉(zhuǎn)變成非黑色素瘤系、更具侵襲性的狀態(tài)。
各種數(shù)據(jù)表明，即使在同基因細(xì)胞系中，在BRAFi處理后不同的細(xì)胞亞群也可能表現(xiàn)出不同的生物學(xué)行為。MITF-High和MITF-Low亞群可能代表了在藥物治療后分別遵循上、下兩條獨(dú)立路徑發(fā)展的細(xì)胞。
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通過臨界點(diǎn)分析確定軌跡分叉的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
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