癌癥耐藥性是癌癥治療中的一個重大挑戰，導致療效不佳或治療后復發。當前，研究人員利用前沿技術加深對腫瘤耐藥機制的了解，嘗試開發出可繞過腫瘤耐藥機制的個體化聯合療法。

其中，單細胞蛋白質組學分析技術可在單細胞的分辨率上檢測胞內信號通路相關的多重磷酸化蛋白，了解異質性腫瘤細胞的整個胞內信號網絡，及其在藥物作用下的變化，從而加速發現腫瘤耐藥機制，為設計新型有效的腫瘤聯合療法及新靶點發現提供新的見解和指導。

圖示腫瘤耐藥發展路徑

在阻斷腫瘤的主要信號通路后，可能有部分腫瘤細胞通過其他信號旁路繼續維持存活或增殖，導致耐藥發生

來自加州理工學院David Baltimore課題組、西雅圖系統醫學研究院James R. Heath課題組和蘇州系統醫學研究所的Guideng Li課題組，在Nat Communications(IF: 14.919)上發表的一篇名為“Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line”的文章，闡述如何利用單細胞多組學技術研究腫瘤的耐藥性發展，以及如何尋找新的潛在治療靶點。

文章摘要

通過高維空間細胞狀態確定單個細胞的軌跡，對于理解從細胞分化到藥物處理后的疾病細胞表觀遺傳學反應等生物學變化是一個巨大的挑戰。該研究通過理論和實驗相結合的方式，確定了BRAF^V600E突變的單個黑色素瘤細胞從藥物敏感到藥物耐受狀態之間的發展軌跡。盡管單細胞組學工具可以幫助生成某個時間點的細胞狀態圖譜，但確定單個細胞的空間軌跡可能會被隨機的細胞狀態切換所混淆。

研究人員在藥物處理后5天時間內分析了腫瘤細胞的一系列信號通路、細胞表型和代謝調節因子，揭示了在藥物敏感和藥物耐受狀態之間的兩條路徑的細胞狀態變化。特定細胞的發展軌跡取決于譜系限制性轉錄因子的藥物反應水平。每條軌跡都顯示出獨特的藥物敏感性，揭示了同基因細胞群體中適應性耐藥發展的新模式。

研究思路

建立BRAFi誘導的黑色素瘤細胞耐藥模型

建立BRAFi誘導的黑色素瘤細胞耐藥模型

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通過單細胞多組學技術檢測耐藥發展中各種蛋白和代謝物的變化

降維分析顯示腫瘤耐藥發展的不同軌跡

通過臨界點分析確定軌跡分叉的關鍵調節因素，即潛在治療靶標

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研究結果

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通過單細胞蛋白組和代謝組分析揭示黑素瘤細胞耐藥途徑

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研究人員利用病人來源的BRAF^V600E突變黑素瘤細胞系(M397)，建立了靶向抑制劑誘導的快速藥物耐受模型。在BRAF抑制劑(BRAFi)作用下，這些高度可塑性細胞從初始的藥物敏感狀態轉變成后期耐藥狀態（圖1a），研究人員通過單細胞條形碼芯片(SCBC)進行功能蛋白質組和代謝物分析，研究這一過程中相關的表型標志物和致癌信號標志物、腫瘤信號轉導、細胞增殖和代謝活動等，洞察腫瘤耐藥產生的關鍵機制。

圖1. 黑素瘤M397細胞在BRAFi處理不同天數后采用IsoPlexis單細胞蛋白組和代謝組芯片進行分析

在BRAFi處理后0、1、3、5天，M397細胞通過SCBC中成千上萬個微室分離單細胞，然后對每個單細胞進行原位裂解，釋放其胞內組分。每個微室含有全套條形碼陣列，通過捕獲抗體或分子探針與特定靶蛋白或代謝物結合（圖1a）。

研究結果顯示（圖1b）

因此，單細胞蛋白質組學和代謝組的聯合分析，提供了證據表明D1初始藥物反應、D3藥物誘導細胞狀態變化、D5出現藥物耐受，有助于早期發現藥物抵抗，而無需等到數周后出現細胞增殖才能判斷耐藥。

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降維分析提示多種細胞發展軌跡

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通過降維分析顯示藥物處理后單細胞多標志物隨時間的協調變化。FLOW-MAP分析顯示，M397黑色素瘤細胞隨著藥物處理時間延長，呈現不同的群體聚集特點及演變軌跡：

在BRAFi處理前(d0)

大多數M397細胞表達蛋白水平均一，部分蛋白表達水平差異較大，如N-cadherin、MITF、HIF1α、Ki67和MART1。

一小部分細胞表達低水平的Ki67、MITF和MART1（圖2中MITF、MART1和Ki67方框中的虛線部分），提示這是一群去分化、分裂緩慢的細胞。

在BRAFi處理后，細胞群體最初分裂為兩群，分布在FLOW-MAP圖的兩個區域。

在d1，大多數細胞聚集在d0細胞的右上方，而小部分亞群直接聚集在d0組的右側。

這種趨勢在d3處繼續，大多數細胞聚集在d1上方，而少數細胞聚集在d1一小群細胞的右側。

到d5時，所有細胞都聚集到圖形的右方。

在d1和d3細胞分叉狀態意味著細胞耐藥朝上、下兩種軌跡發展的可能性。

因此，對單細胞數據集的計算分析表明，在BRAFi適應的早期階段出現了兩種不同的藥物反應軌跡。

圖2. 單細胞蛋白組和代謝組學數據分析結果

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Surprisal分析揭示兩條不同的耐藥發展軌跡

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采用Surprisal分析單細胞數據，鑒定了兩種主要的耐藥發展模式：模式1和2（圖3a）。這兩個模式中所有的檢測分析物的預測性表達與單細胞檢測數據非常匹配，表明這兩個模式重現了細胞在為期5天的藥物處理過程中的所有分子特征的總體變化。每個模式的評分表示模式相關分析物在細胞中富集或抑制的程度，并將得分進行顏色編碼對應到相應的分層圖上（圖3a）。

模式1的評分在上下兩條路徑上都從負值（藍色）逐漸增加到正值（紅色），并且在中間時間點有清楚的變化，表明在軌跡過渡中存在一個生物物理屏障（圖3a），意味著細胞狀態的轉變及不同細胞狀態之間的界限?？紤]到模式1評分與Ki67表達負相關，與NGFR/AXL表達正相關，模式1評分隨時間的變化似乎可以反映d1到d3期間從藥物敏感狀態到藥物耐受狀態的轉換。

模式2也展現出類似的變化。值得注意的是，黑素瘤細胞表型轉錄因子MITF及其下游蛋白MART1的表達均與模式2評分呈負相關（圖3b），提示兩條路徑的分叉可能與上述兩種蛋白密切關聯。

圖3. Surprisal分析顯示耐藥發展的兩種模式

Surprisal分析為細胞從藥物敏感狀態轉變成耐藥狀態的上下兩條路徑提供了理論支持。研究人員后續通過一系列實驗對此進行了驗證。根據模式2，未經藥物處理的細胞(D0)含有兩種狀態的細胞，可通過MITF和MART1的表達加以區分，其中MITF-Low細胞在藥物處理后可能通過下面的路徑轉變，而MITF-High細胞則通過上面的路徑發展。通過MITF-GFP報告基因細胞系分選出GFP高表達(MITF-high)和低表達(MITF-Low)的細胞，研究發現MITF-high細胞表達更高水平的Ki67和MITF以及更短的倍增時間，說明細胞表型從黑色素瘤系、高度增殖的狀態轉變成非黑色素瘤系、更具侵襲性的狀態。

各種數據表明，即使在同基因細胞系中，在BRAFi處理后不同的細胞亞群也可能表現出不同的生物學行為。MITF-High和MITF-Low亞群可能代表了在藥物治療后分別遵循上、下兩條獨立路徑發展的細胞。

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通過臨界點分析確定軌跡分叉的關鍵調節因子

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