中空纖維切向流過(guò)濾：高效純化無(wú)脊椎血紅蛋白
簡(jiǎn)介
輸血是臨床上最常使用的治療手段之一，但其常面臨季節(jié)性短缺以及特殊血型獻(xiàn)血不足等問(wèn)題，在缺乏特定檢測(cè)及儲(chǔ)存設(shè)備的欠發(fā)達(dá)地區(qū)，該問(wèn)題尤為嚴(yán)重。為解決輸血制品的經(jīng)濟(jì)、安全及供應(yīng)問(wèn)題，近年來(lái)，科學(xué)家開(kāi)始關(guān)注于血紅蛋白氧載體（HBOC）的開(kāi)發(fā)。傳統(tǒng)的HBOC來(lái)源主要為哺乳動(dòng)物，雖具有極大臨床潛力，但在制備過(guò)程中，不可避免地出現(xiàn)諸多副反應(yīng)，如血紅蛋白（Hb）四聚體解聚，從而滲出血管或腎小管壁，引起組織或腎臟毒性；又或Hb被氧化，失去攜氧能力；純化的Hb也易受一氧化氮（NO）的影響。
陸生蚯蚓（Lumbricus terrestris）沒(méi)有紅細(xì)胞，但含有一種獨(dú)特的血紅蛋白，稱(chēng)為無(wú)脊椎動(dòng)物動(dòng)物血紅蛋白（LtEc），其是由144個(gè)Hb亞單位和36個(gè)交聯(lián)蛋白組成的大分子，非常穩(wěn)定，耐氧化，已有實(shí)驗(yàn)證明，LtEC可在小鼠及大鼠體內(nèi)運(yùn)輸O2，而無(wú)明顯長(zhǎng)期副作用，所以被認(rèn)為可用于替代捐獻(xiàn)來(lái)源人體紅細(xì)胞。
LtEc應(yīng)用的前提是建立安全、高效的制備工藝，曾有實(shí)驗(yàn)嘗試使用體積排阻層析和超速離心，但收率和規(guī)模放大性都差強(qiáng)人意。本文嘗試使用切向流過(guò)濾（TFF）純化LtEc，并測(cè)試所得產(chǎn)物的純度、產(chǎn)量、粘度、高鐵血紅蛋白水平、膠體滲透壓、氧結(jié)合平衡以及配體結(jié)合動(dòng)力學(xué)等參數(shù)，并進(jìn)行倉(cāng)鼠輸血實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了產(chǎn)物的安全性。
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實(shí)驗(yàn)
每批次實(shí)驗(yàn)使用2L蚯蚓，漂洗去除泥土和粘液后，均質(zhì)勻漿，去除固體碎片，上清液再離心后，濾紙過(guò)濾，去除較大的顆粒。
初步澄清過(guò)濾采用兩根并聯(lián)的0.2μm中空纖維切向流過(guò)濾組件（產(chǎn)品編號(hào)：M1-M02E-360-F1S；膜表面積：1050cm2；膜材質(zhì)：PES），得到2L濾液；濾液先用500kD中空纖維切向流過(guò)濾組件（產(chǎn)品編號(hào)：M2-500S-100-01P;膜表面積：1050cm2；膜材質(zhì)：PS）濃縮至200ml；回流液再進(jìn)行10體積洗濾，前8體積使用Tris緩沖液，后2體積改用改良乳酸林格式溶液。洗濾采用間斷模式，即先稀釋至2L后，再濃縮至200ml。最后1體積洗濾后，回流液濃縮至20-50ml，再用0.22μm針頭式濾器除菌過(guò)濾。整個(gè)切向流過(guò)濾工藝流速均穩(wěn)定為480ml/min。
純化后的樣品采用SDS-PAGE分析蛋白濃縮，以*化高鐵血紅蛋白測(cè)定法檢測(cè)氧化LtEc（MetHb）水平，以MALDI-MS分析樣品分子量，以血分析儀分析O2平衡曲線和結(jié)合/解離動(dòng)力學(xué)，并測(cè)試產(chǎn)物粘度和膠體滲透壓。
此外，使用倉(cāng)鼠進(jìn)行純化LtEc的超容量輸血實(shí)驗(yàn)，輸血過(guò)程監(jiān)測(cè)血漿蛋白濃度，并監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓（MAP）、心率（HR）、功能性毛細(xì)血管密度（FCD）、動(dòng)/靜脈血液流速等指標(biāo)。
結(jié)果
SDS-PAGE結(jié)果顯示，使用0.2μm過(guò)濾器進(jìn)行澄清可去除大分子量的凝血蛋白聚合物等雜質(zhì)，多次洗濾后，小分子雜質(zhì)亦可去除，而LtEc被濃縮，且所得產(chǎn)物條帶分子量與理論值基本一致。
MALDI-MS結(jié)果也證明，所得產(chǎn)物分子量與理論值符合，且無(wú)較大雜質(zhì)峰存在。每批次LtEc的收率為5g左右，且metHb含量極低（~3%）。說(shuō)明TFF在保證收率的同時(shí)，可最大程度地維持LtEc的穩(wěn)定性。純化LtEc的O2親和性（P50）與bHb或人全血相似，O2釋放常數(shù)也無(wú)太大差異，而CO結(jié)合常數(shù)顯著較低，也不易受NO攻擊。
實(shí)驗(yàn)通過(guò)倉(cāng)鼠輸血模型檢測(cè)純化LtEc的安全性，結(jié)果顯示，無(wú)顯著免疫或過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，從MAP及血管直徑參數(shù)看，LtEc不會(huì)造成血管緊縮或高血壓，反而在較高血漿濃度條件下，血管會(huì)輕微舒張。LtEc不會(huì)引起HR降低，升高濃度后，動(dòng)脈血液流速加快，此外，一定濃度的LtEc可增加FCD，說(shuō)明其可糾正失血性休克時(shí)的毛細(xì)血管塌陷問(wèn)題。
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討論
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TFF純化工藝可用于制備高純度的完整LtEc，且純化的LtEc可有效結(jié)合并釋放O2，其O2親和性與人體全血相近，而不易受CO攻擊，表明其是高效的體內(nèi)O2載體。純化LtEc的粘度和COP也與人體全血接近，這使其在輸血治療出血性休克時(shí)，可將液體有效驅(qū)入毛細(xì)血管，提高循環(huán)體積，維持FCD，恢復(fù)O2輸送。在倉(cāng)鼠輸血實(shí)驗(yàn)中，也未觀察到高血壓、血管緊縮或過(guò)敏反應(yīng)等現(xiàn)象，證實(shí)了純化LtEc的安全性。可見(jiàn)，TFF是LtEc純化的高效手段，可進(jìn)行進(jìn)一步的規(guī)模放大實(shí)驗(yàn)。