更靈敏，更特異，更精確

——數字PCR技術的發展與應用簡介

數字PCR技術的原理

數字PCR（Digital PCR-dPCR）技術是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統定量PCR（qPCR）技術不同，數字PCR采用絕對定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數。由于這種檢測方式具有比傳統qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應用，這項技術在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現出的優勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面具有的廣闊應用前景已經受到越來越多的關注。

數字PCR采用的策略概括起來非常簡單，就是“分而治之”（devide and conquer）[1]，這種做法非常類似于計算機科學中的“分治算法”，將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ，實現“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數目“數出”目標序列的拷貝數。在實際的數字PCR實驗中，事實上是通過呈現兩種信號類型的反應器比例和數目進行統計學分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數。

圖1. 數字PCR的原理（圖片來源http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/pcr/digital-pcr.html）

數字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測；此外，由于數字PCR在進行結果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數字PCR的反應受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高；數字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數字PCR技術也特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。

數字PCR技術的發展歷史

從以上介紹我們可以看到，事實上數字PCR與傳統定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺基礎——聚合酶鏈式反應和雙鏈DNA標記技術，但兩者采用的是完全不同的定量策略和思想方法， dPCR和qPCR并沒有實驗方法和思路上的承繼關系，從這個角度來說，目前很多人把數字PCR稱為第三代PCR技術并不準確。

在實時定量PCR技術成熟和發展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯醫學中心的科學家使用有限稀釋、PCR和泊松分布數據校正模型的方法（ limiting dilution, PCR and Poisson statistics），檢測了復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因，進行了極其精細的定量研究［2］，雖然當時這種方法并沒有被冠以“數字PCR”之名，但已經建立了數字PCR基本的實驗流程，更重要的是了數字PCR檢測中一個極其重要的原則——以“終點信號的有或無”（all-or-none end point ）作為判斷標志，這也是之后1999年Bert Vogelstein 和 Ken Kinzler將之命名為“數字PCR”(digital PCR)的主要原因 [3]。

數字PCR技術的原理非常簡單，然而在樣品分散（divide）的環節上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應的載體，或者采用類似流式技術的磁珠乳液擴增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了第一臺商品化的基于芯片的商品化數字PCR系統。2008年德國 Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴增和流式檢測方式的BEAMing dPCR 檢測服務，但這些方法無論在分散程度和數據群體的體量上都無法達到更加精細的要求，時間和耗材成本嚴重限制了dPCR技術的發展。

近幾年來，隨著納米制造技術和微流體技術（nanofabrication and microfluidics）的發展，數字PCR技術遇到了突破技術瓶頸的最佳契機。1997年Kalinina, 、Brown J, 和Silver J使用納升級芯片進行單克隆模板PCR擴增，獲得了美國**，更重要的是這種采用“電浸潤法”進行納升級芯片制造技術顯露雛形［4］。伴隨二代測序技術發展起來的“油包水PCR”技術，可以一次生成數萬乃至數百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。

QuantaLife 利用油包水微滴生成技術 開發了微滴式數字PCR技術，這也是最早出現的相對成熟的數字PCR平臺，在運行成本和實驗結果穩定性方面都基本達到了商品化的標準。2011年，QuantaLife 公司被BioRad公司收購，其微滴式數字PCR儀產品更名為QX100型號儀繼續在市場上銷售，這個早期型號為dPCR概念的普及和應用領域的拓展發揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級型號QX200。

2012年，RainDance公司推出Raindrop型號數字PCR設備，這個設備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術平移到數字PCR技術平臺，在高壓氣體驅動下，將每個標準反應體系分割成包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反應乳液， 該公司的創始人之一Darren Link表示這種超高的微滴數目可以為用戶“提供更高的檢測動態范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品” [1]。

2013年下半年，Life Technologies推出了QuantStudio 3D數字PCR系統， 這也是目前數字PCR市場上最新型號的產品。采用高密度的納升流控芯片技術，樣本均勻分配至20,000個單獨的反應孔中。在整個工作流程中，樣本之間保持完全隔離 ，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過程，簡化操作步驟。同時芯片式設計避免了微滴式系統可能面臨的管路堵塞問題 [5]。

作為Life-technologies在OpenArray芯片平臺之外推出的全新的芯片式數字PCR系統，值得一提的是，這個全新的系統在設計理念上綜合考慮了系統穩定性與運行成本因素，直接反映了該系統“適合所有分子生物學實驗室使用的數字PCR系統”的市場定位。

數字PCR技術的應用領域

從上世紀90年代以來qPCR技術的爆發式發展使得現代核酸檢測技術具有全新的面貌，而進入二十一世紀之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測序技術正在迅速發展，也是目前競爭最為激烈的研究領域之一，即使在這種情況下，dPCR技術仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學領域爭取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統的qPCR應用領域，也有一些實驗室同時選擇dPCR平臺進行平行實驗以保證實驗結果的準確和可重復性 [5]。

在基因組變異研究領域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態性）檢測面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時存在，競爭性反應嚴重影響突變序列的檢測精度，數字PCR技術帶來的極高的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優勢，在癌癥標志物檢測、無創產前檢查、線粒體突變檢測等研究方向上，我們已經看到dPCR的許多精彩表現。

CNV（Copy Number Variations，拷貝數變異）研究需要極高的定量精度以區別不同拷貝數之間的微小差異，測序方法適用于高于30%的變異率檢測，而qPCR的最高分辨在1.5倍左右，數字PCR通過直接計數目標基因與參照基因( 拷貝數為1的基因，例如RNaseP) 的數目，計算比值，直接得到目標基因的拷貝數可以達到極高的拷貝數分辨精度 [5]。