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2021年1月15日上午11:30，中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)細(xì)胞死亡分會(huì)開展線上學(xué)術(shù)交流系列講座第11期，本期講座通過(guò)“騰訊會(huì)議”進(jìn)行實(shí)時(shí)直播，主講人為艾有為博士，來(lái)自北京生命科學(xué)研究所王曉東實(shí)驗(yàn)室的博士后。本期講座由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研究組長(zhǎng)丁璟珒博士和西湖大學(xué)助理教授鄒貽龍博士主持，特邀暨南大學(xué)何蓉蓉教授和中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所尹慧勇教授作為點(diǎn)評(píng)嘉賓。共同探討POR和CYB5R1作為鐵死亡正向調(diào)控因子，如何介導(dǎo)磷脂過(guò)氧化過(guò)程的分子機(jī)制。

鐵死亡（ferroptosis）是一類由鐵離子依賴的多不飽和脂肪酸磷脂過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞死亡模式。鐵死亡最早由Brent R. Stockwell 教授于2012年發(fā)現(xiàn)并命名。鐵死亡被發(fā)現(xiàn)在多種器官，包括腎和大腦的損傷或退行性疾病中發(fā)揮作用。與此同時(shí)，在多種癌癥中，鐵死亡通路被認(rèn)為是非常有潛力的可靶向通路。

目前鐵死亡研究領(lǐng)域有兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題亟待更多的機(jī)制研究: 1.鐵死亡通路中的正向調(diào)控因子的鑒定，可以為多種疾病包括癌癥提供靶點(diǎn); 2.多不飽和脂肪酸磷脂的過(guò)氧化發(fā)生機(jī)制。在鐵死亡研究領(lǐng)域，大量研究對(duì)細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)，關(guān)鍵調(diào)控因子包括GPX4,FSP1,xCT, GCH1等。其中GPX4(谷胱甘肽過(guò)氧化酶4)以GSH(谷胱甘肽)為還原劑，將脂質(zhì)過(guò)氧化物還原為對(duì)應(yīng)的醇，從而保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。但是對(duì)于引發(fā)細(xì)胞鐵死亡的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的分子機(jī)制還缺乏研究。先前研究指向脂氧合酶（lipoxygenases）是多不飽和脂肪酸磷脂過(guò)氧化的催化酶，但是最近的研究卻發(fā)現(xiàn)lipoxygenases的小分子抑制劑具有捕獲自由基的活性(radical-trapping activity)，可能導(dǎo)致了‘抑制lipoxygenases的活性可以抑制鐵死亡’的錯(cuò)誤結(jié)論。與此同時(shí)，lipoxygenases在大多數(shù)可以發(fā)生鐵死亡的癌細(xì)胞中表達(dá)甚少，因此對(duì)介導(dǎo)鐵死亡過(guò)程中磷脂過(guò)氧化的真正催化酶亟需更深入研究。

艾博士的研究中，偶然發(fā)現(xiàn)了一個(gè)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抑制劑，PACMA31，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并且通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)的方法鑒定了其直接靶向蛋白為GPX4。通過(guò)化合物庫(kù)的篩選，艾博士進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能與PACMA31協(xié)同促進(jìn)鐵死亡的小分子，Regorafenib。Regorafenib能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的胱氨酸水平誘發(fā)細(xì)胞的鐵死亡。以這兩個(gè)小分子抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡系統(tǒng)為基礎(chǔ)，作者開展了全基因組范圍內(nèi)的CRISPR/Cas9篩選，以無(wú)偏向性的手段研究鐵死亡過(guò)程中的正向調(diào)控因子。在作者的篩選中，發(fā)現(xiàn)了ACSL4, Cytochrome P450 Oxidoreductase (POR)等蛋白，其中ACSL4是領(lǐng)域內(nèi)已知的通過(guò)調(diào)節(jié)介導(dǎo)鐵死亡的底物即多不飽和脂肪酸磷脂（PUFA-PL）的水平來(lái)間接影響細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性，證明了本次篩選的有效行。與此同時(shí)，在稍早的另一篇文章(Zou et al., Nature Chemical Biology 2020)中，鄒貽龍博士也獨(dú)立的鑒定并報(bào)導(dǎo)了POR在細(xì)胞內(nèi)行使鐵死亡正向調(diào)控因子的作用，并且將POR的生化作用鎖定在了磷脂過(guò)氧化這一步驟。由于POR的敲除并不能完全消除細(xì)胞對(duì)于鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性，作者猜測(cè)除了POR，細(xì)胞中還有其他蛋白也會(huì)正向調(diào)控細(xì)胞鐵死亡的敏感性。經(jīng)過(guò)小范圍的shRNA screen，作者發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)蛋白，CYB5R1，同樣能正向調(diào)控細(xì)胞的鐵死亡，雖然其對(duì)于鐵死亡的貢獻(xiàn)比POR略弱。在正常情況下，POR和CYB5R1分別將NADPH和NADH的電子傳遞給下游CYP450等蛋白。在艾博士的工作中，通過(guò)一系列生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，提出了POR和CYB5R1通過(guò)以電子傳遞功能依賴的方式，將泄漏的電子傳遞給溶解的氧氣，導(dǎo)致H₂O₂的積累的作用方式。艾博士進(jìn)一步推測(cè)，H₂O₂在活性亞鐵離子(Fe²⁺)存在的情況下，發(fā)生芬頓反應(yīng)(Fenton Chemistry)產(chǎn)生羥基自由基，活躍的羥基自由基進(jìn)而攻擊不飽和脂肪酸長(zhǎng)鏈雙鍵間(1,4-diene)的氫原子，引發(fā)脂質(zhì)脫氫和過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng), 并最終導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。此外，艾博士以表達(dá)純化的POR，CYB5R1蛋白和liposome在體外重建了POR，CYB5R1催化脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致liposome破裂的生化過(guò)程, 為鐵死亡過(guò)程中細(xì)胞膜過(guò)氧化損傷的提供了獨(dú)特的理論依據(jù)。

艾博士精彩的報(bào)告，引起了大家熱烈的討論，大家主要討論的問(wèn)題包括了：在生理?xiàng)l件下H₂O₂是如何能將電子傳遞到質(zhì)膜的多不飽和脂肪酸鏈上，進(jìn)而引發(fā)脂質(zhì)的過(guò)氧化，以及H₂O₂ 在活體細(xì)胞中是否真正直接參與到鐵死亡的誘發(fā)過(guò)程中；是否還存在除H₂O₂外的其他親脂性的自由基也參與了起始多不飽和脂肪酸磷脂的過(guò)氧化過(guò)程；如果H₂O₂是引發(fā)鐵死亡的主要因子，為什么細(xì)胞內(nèi)其他產(chǎn)生H₂O₂的蛋白沒(méi)有在篩選中鑒定出來(lái)；另外，其它幾項(xiàng)研究也提出直接改變細(xì)胞培養(yǎng)體系的H₂O₂水平，并不能影響細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性和為什么H₂O₂ 過(guò)量富集引起的細(xì)胞死亡并不能被鐵死亡抑制劑所rescue等問(wèn)題。一個(gè)小時(shí)的深入討論和交流，給我們帶來(lái)了更多的思考和理解，為未來(lái)的研究指明了方向。本次學(xué)術(shù)會(huì)議在鄒貽龍博士號(hào)召更多領(lǐng)域的專家學(xué)者加入到攻克鐵死亡的機(jī)制和藥物研發(fā)瓶頸的努力中而圓滿結(jié)束。

Ferroptosis Antibody Sampler Kit #29650

Redox Homeostasis and Signaling Antibody Sampler Kit #16815

檢測(cè)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽：Cellular Glutathione Detection Assay Kit #13859

僅供研究使用。不得用于診斷流程。

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