2021年1月15日上午11:30，中國細胞生物學學會細胞死亡分會開展線上學術交流系列講座第11期，本期講座通過“騰訊會議”進行實時直播，主講人為艾有為博士，來自北京生命科學研究所王曉東實驗室的博士后。本期講座由中國科學院生物物理研究所研究組長丁璟珒博士和西湖大學助理教授鄒貽龍博士主持，特邀暨南大學何蓉蓉教授和中國科學院上海營養與健康研究所尹慧勇教授作為點評嘉賓。共同探討POR和CYB5R1作為鐵死亡正向調控因子，如何介導磷脂過氧化過程的分子機制。
鐵死亡（ferroptosis）是一類由鐵離子依賴的多不飽和脂肪酸磷脂過氧化驅動的細胞死亡模式。鐵死亡最早由Brent R. Stockwell 教授于2012年發現并命名。鐵死亡被發現在多種器官，包括腎和大腦的損傷或退行性疾病中發揮作用。與此同時，在多種癌癥中，鐵死亡通路被認為是非常有潛力的可靶向通路。
目前鐵死亡研究領域有兩個關鍵問題亟待更多的機制研究: 1.鐵死亡通路中的正向調控因子的鑒定，可以為多種疾病包括癌癥提供靶點; 2.多不飽和脂肪酸磷脂的過氧化發生機制。在鐵死亡研究領域，大量研究對細胞的抗氧化系統進行了報導，關鍵調控因子包括GPX4,FSP1,xCT, GCH1等。其中GPX4(谷胱甘肽過氧化酶4)以GSH(谷胱甘肽)為還原劑，將脂質過氧化物還原為對應的醇，從而保護細胞免受脂質過氧化損傷。但是對于引發細胞鐵死亡的脂質過氧化過程的分子機制還缺乏研究。先前研究指向脂氧合酶（lipoxygenases）是多不飽和脂肪酸磷脂過氧化的催化酶，但是最近的研究卻發現lipoxygenases的小分子抑制劑具有捕獲自由基的活性(radical-trapping activity)，可能導致了‘抑制lipoxygenases的活性可以抑制鐵死亡’的錯誤結論。與此同時，lipoxygenases在大多數可以發生鐵死亡的癌細胞中表達甚少，因此對介導鐵死亡過程中磷脂過氧化的真正催化酶亟需更深入研究。
艾博士的研究中，偶然發現了一個蛋白質二硫鍵異構酶抑制劑，PACMA31，能夠誘導細胞死亡，并且通過化學偶聯的方法鑒定了其直接靶向蛋白為GPX4。通過化合物庫的篩選，艾博士進一步發現了一個能與PACMA31協同促進鐵死亡的小分子，Regorafenib。Regorafenib能通過調節細胞內的胱氨酸水平誘發細胞的鐵死亡。以這兩個小分子抑制劑誘導的細胞鐵死亡系統為基礎，作者開展了全基因組范圍內的CRISPR/Cas9篩選，以無偏向性的手段研究鐵死亡過程中的正向調控因子。在作者的篩選中，發現了ACSL4, Cytochrome P450 Oxidoreductase (POR)等蛋白，其中ACSL4是領域內已知的通過調節介導鐵死亡的底物即多不飽和脂肪酸磷脂（PUFA-PL）的水平來間接影響細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性，證明了本次篩選的有效行。與此同時，在稍早的另一篇文章(Zou et al., Nature Chemical Biology 2020)中，鄒貽龍博士也獨立的鑒定并報導了POR在細胞內行使鐵死亡正向調控因子的作用，并且將POR的生化作用鎖定在了磷脂過氧化這一步驟。由于POR的敲除并不能完全消除細胞對于鐵死亡誘導劑的敏感性，作者猜測除了POR，細胞中還有其他蛋白也會正向調控細胞鐵死亡的敏感性。經過小范圍的shRNA screen，作者發現了另一個蛋白，CYB5R1，同樣能正向調控細胞的鐵死亡，雖然其對于鐵死亡的貢獻比POR略弱。在正常情況下，POR和CYB5R1分別將NADPH和NADH的電子傳遞給下游CYP450等蛋白。在艾博士的工作中，通過一系列生物化學實驗，提出了POR和CYB5R1通過以電子傳遞功能依賴的方式，將泄漏的電子傳遞給溶解的氧氣，導致H2O2的積累的作用方式。艾博士進一步推測，H2O2在活性亞鐵離子(Fe2+)存在的情況下，發生芬頓反應(Fenton Chemistry)產生羥基自由基，活躍的羥基自由基進而攻擊不飽和脂肪酸長鏈雙鍵間(1,4-diene)的氫原子，引發脂質脫氫和過氧化鏈式反應, 并最終導致細胞鐵死亡。此外，艾博士以表達純化的POR，CYB5R1蛋白和liposome在體外重建了POR，CYB5R1催化脂質過氧化導致liposome破裂的生化過程, 為鐵死亡過程中細胞膜過氧化損傷的提供了獨特的理論依據。
艾博士精彩的報告，引起了大家熱烈的討論，大家主要討論的問題包括了：在生理條件下H2O2是如何能將電子傳遞到質膜的多不飽和脂肪酸鏈上，進而引發脂質的過氧化，以及H2O2 在活體細胞中是否真正直接參與到鐵死亡的誘發過程中；是否還存在除H2O2外的其他親脂性的自由基也參與了起始多不飽和脂肪酸磷脂的過氧化過程；如果H2O2是引發鐵死亡的主要因子，為什么細胞內其他產生H2O2的蛋白沒有在篩選中鑒定出來；另外，其它幾項研究也提出直接改變細胞培養體系的H2O2水平，并不能影響細胞對鐵死亡的敏感性和為什么H2O2 過量富集引起的細胞死亡并不能被鐵死亡抑制劑所rescue等問題。一個小時的深入討論和交流，給我們帶來了更多的思考和理解，為未來的研究指明了方向。本次學術會議在鄒貽龍博士號召更多領域的專家學者加入到攻克鐵死亡的機制和藥物研發瓶頸的努力中而圓滿結束。
Ferroptosis Antibody Sampler Kit #29650
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產品包括 |
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WB |
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WB IP |
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100 μl |
WB |
Redox Homeostasis and Signaling Antibody Sampler Kit #16815
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產品包括 |
數量 |
應用 |
反應性 |
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20 μl |
WB |
H |
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WB |
H M Mk |
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20 μl |
WB |
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WB IP |
H |
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100 μl |
WB |
檢測胞內還原型谷胱甘肽：Cellular Glutathione Detection Assay Kit #13859
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組分包括 |
數量（計數） |
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Reduced Glutathione Standard |
1 x 1 次 |
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Glutathione-S-Transferase |
1 x 1 次 |
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Tris Assay Buffer |
1 x 25 ml |
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Digitonin Lysis Buffer |
1 x 11 ml |
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Monochlorobimane |
1 x 1 次 |
僅供研究使用。不得用于診斷流程。
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