人 C 反應(yīng)蛋白 ELISA 試劑盒
產(chǎn)品編號(hào)：SEKH-0138
適用于人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本
背景介紹：
? ? ? ?CRP 是機(jī)體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時(shí)肝細(xì)胞合成的急性期蛋白，可在 24 至 48 小時(shí)內(nèi)增加 1000 倍。CRP 蛋白由 206 個(gè)氨基酸組成，大小約 23kDa，CRP 屬于穿透素家族成員之一，由 5 個(gè)相同的亞單位以非共價(jià)鍵形式結(jié)合，形成對(duì)稱(chēng)的環(huán)狀五球體，中間環(huán)繞一孔型結(jié)構(gòu)，其凹面含有配體結(jié)合位
點(diǎn)。 IL-6、IL-1β和糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)肝 CRP 合成和釋放。CRP 能與磷脂酰膽堿（phosphory,PC）、脂蛋白、脂多糖，染色質(zhì)、半乳糖、膽固醇等多重配體結(jié)合。這些配體是細(xì)胞、真菌或人類(lèi)細(xì)胞壁的成分，當(dāng)這些物質(zhì)由入侵微生物或受到損傷自身細(xì)胞釋放出來(lái)時(shí)，CRP 就可以通過(guò) Ca2+或其本身的陽(yáng)離子結(jié)合部位
與之結(jié)合，經(jīng)過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，清除外來(lái)致病因子及損傷細(xì)胞，為組織修復(fù)創(chuàng)造條件。與配體結(jié)合后，CRP 激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng),也可以與 FcγRI(CD64)和 FcγRIIA(CD32a)結(jié)合，活化吞噬細(xì)胞作用。?
? ? ? ?CRP 是機(jī)體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時(shí)肝細(xì)胞合成的急性期蛋白，可在 24 至 48 小時(shí)內(nèi)增加 1000 倍。CRP 蛋白由 206 個(gè)氨基酸組成，大小約 23kDa，CRP 屬于穿透素家族成員之一，由 5 個(gè)相同的亞單位以非共價(jià)鍵形式結(jié)合，形成對(duì)稱(chēng)的環(huán)狀五球體，中間環(huán)繞一孔型結(jié)構(gòu)，其凹面含有配體結(jié)合位
點(diǎn)。 IL-6、IL-1β和糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)肝 CRP 合成和釋放。CRP 能與磷脂酰膽堿（phosphory,PC）、脂蛋白、脂多糖，染色質(zhì)、半乳糖、膽固醇等多重配體結(jié)合。這些配體是細(xì)胞、真菌或人類(lèi)細(xì)胞壁的成分，當(dāng)這些物質(zhì)由入侵微生物或受到損傷自身細(xì)胞釋放出來(lái)時(shí)，CRP 就可以通過(guò) Ca2+或其本身的陽(yáng)離子結(jié)合部位
與之結(jié)合，經(jīng)過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，清除外來(lái)致病因子及損傷細(xì)胞，為組織修復(fù)創(chuàng)造條件。與配體結(jié)合后，CRP 激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng),也可以與 FcγRI(CD64)和 FcγRIIA(CD32a)結(jié)合，活化吞噬細(xì)胞作用。?
檢測(cè)原理：
? ? ? ?Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。將抗人 CRP 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人 CRP 會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗人 CRP 抗體，該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人 CRP 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的人CRP，則 HRP 會(huì)使無(wú)色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測(cè)定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的人 CRP 濃度與 OD 成正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中人 CRP 的濃度。?
? ? ? ?Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。將抗人 CRP 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人 CRP 會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗人 CRP 抗體，該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人 CRP 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的人CRP，則 HRP 會(huì)使無(wú)色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測(cè)定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的人 CRP 濃度與 OD 成正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中人 CRP 的濃度。?
原理圖：
注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請(qǐng)不要使用過(guò)期的試劑。
2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)丟棄。
3. 試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測(cè)，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請(qǐng)不要使用過(guò)期的試劑。
2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)丟棄。
3. 試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測(cè)，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過(guò)程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶蓋上，使用前請(qǐng)離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請(qǐng)用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請(qǐng)不要使用其他來(lái)源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。?
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請(qǐng)不要使用其他來(lái)源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。?
安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù)；在操作過(guò)程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請(qǐng)用大量清水清洗；檢測(cè)血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請(qǐng)按國(guó)家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
試劑盒組成及儲(chǔ)存：
自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購(gòu)）
1． 酶標(biāo)儀（主波長(zhǎng) 450nm，參考波長(zhǎng) 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機(jī)或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù)；在操作過(guò)程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請(qǐng)用大量清水清洗；檢測(cè)血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請(qǐng)按國(guó)家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
試劑盒組成及儲(chǔ)存：
自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購(gòu)）
1． 酶標(biāo)儀（主波長(zhǎng) 450nm，參考波長(zhǎng) 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機(jī)或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲(chǔ)存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無(wú)菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存），保存過(guò)程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測(cè)結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測(cè)濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測(cè)，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。?
試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋?zhuān)杭尤霕?biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，然后在其余六管中各加入500?L標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1），按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋?zhuān)?00、250、125、62.5、31.25、15.62 pg/ml進(jìn)行稀釋。1000pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最高點(diǎn)濃度，
標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的零點(diǎn)（0pg/ml）。復(fù)溶過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。
5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。
6. 洗滌方法：
? 自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
? 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
檢測(cè)步驟：
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋?zhuān)杭尤霕?biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，然后在其余六管中各加入500?L標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1），按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋?zhuān)?00、250、125、62.5、31.25、15.62 pg/ml進(jìn)行稀釋。1000pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最高點(diǎn)濃度，
標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的零點(diǎn)（0pg/ml）。復(fù)溶過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。
5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。
6. 洗滌方法：
? 自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
? 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
檢測(cè)步驟：
結(jié)果判斷：
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定 OD 值。選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)，參考波長(zhǎng)為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，請(qǐng)用 450 nm 的 OD 測(cè)定值減去 630 nm 的 OD 測(cè)定值。
2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，樣品中CRP含量可通過(guò)對(duì)應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。
參數(shù)表征：
1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
2. 靈敏度：
最低可檢測(cè)人 CRP 濃度達(dá) 8pg/ml，
20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測(cè)濃度。
3. 特異性：
不與人 Pentraxin 2、Pentraxin 3 反應(yīng)，小鼠 CRP 等反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。
5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的人 CRP，計(jì)算回收率。
6. 線(xiàn)性稀釋?zhuān)?/span>
分別在選取的 4 份健康人血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 CRP，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋?zhuān)u(píng)估線(xiàn)性。
