?恒溫擴增技術

來源勝創生物

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摘要：恒溫擴增技術是繼PCR技術后發展起來的一門新型的體外核酸擴增技術。目前主要的恒溫擴增技術有：滾環核酸擴增、環介導等溫擴增、鏈替代擴增、依賴核酸序列擴增和解鏈酶擴增。它們都具有共同的特點：恒溫、高效、特異、不需要特殊的儀器設備。本文就現階段恒溫擴增技術的特點及其在動物疫病檢測中的應用情況和前景做一綜述。

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關鍵詞：恒溫擴增；PCR

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引言：

近年來，隨著分子生物學技術的迅速發展，基于核酸檢測的診斷方法已大量建立并廣泛應用于動物疾病的實驗室檢測中，恒溫擴增技術就是在此背景下出現的。與其它的核酸擴增技術相比，恒溫擴增有快速、高效、特異的優點且無需專用設備。所以它一經出現就被許多學者認為是一種有可能與PCR?媲美的檢測方法，目前主要的恒溫擴增技術有：滾環核酸擴增（rolling?circle?amolification，RCA）、環介導等溫擴增（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）、鏈替代擴增（strand?displacement?amplification，SDA）、依賴核酸序列擴增（nucleicacid?sequence?based?amplification，NASBA）?和解鏈酶擴增（helix?dependent?amplification，HAD），這些技術各有特點，這也決定了它們在動物疾病檢測中的應用情況，下面就它們的原理、特點及其在動物疫病檢測中的應用情況進行綜述。

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1?滾環核酸擴增

1.?1?滾環核酸擴增的原理

滾環核酸擴增（rolling?circleamolification,?RCA）是通過借鑒病原生物體滾環復制DNA?的方式而提出的[1]，可分為線性擴增與指數擴增兩種形式。線性RCA?是引物結合到環狀DNA?上后，在DNA?聚合酶作用下被延伸，產物是具有大量重復序列（與環狀DNA?完全互補）的線狀單鏈。線性RCA?用于靶核酸擴增僅限于一些具有環狀核酸的病毒、質粒和環狀染色體，線性擴增倍數為105。指數RCA原理與線性RCA?相同，采用與環狀DNA?序列完全一致的第二種引物，該引物與第一次線性RCA?產物結合并酶促延伸，其產物又作為第一種探針

的模板，這樣一來在很短的時間內（1h），產物呈指數遞增。指數RCA?可用于非環狀DNA?的擴增，增倍數能達107?[2]。

1.?2?滾環核酸擴增的優勢與不足

RCA?的優勢：(1)?高靈敏度。RCA有很強的擴增能力，線性RCA?的效率可達到l05?倍，而指數RCA?的效率可達到109?倍，這一高靈敏度特性使其能夠檢測到單拷貝水平[3]；(2)高序列特異性。可以區分單一位點的不同模式；(3)?擴增產物經過磷酸化處理后可以直接用來測序。(4)高通量。RCA?可以在靶目標上形成閉合的環狀序列，確保RCA?產生的信號集中在一點，從而實現原位擴增和載片擴增；?RCA?只要保證探針的識別段序列與靶序列互補，不需要考慮靶序列的性質，因此檢測RNA?時不再需要預先進行RNA?的逆轉錄。

RCA?的不足：（1）鎖式探針常接近100bp，?合成費用較高。2000?年，Antson?DO?等采用PCR?方法在實驗室合成探針，可以在很大程度上降低成本；（2）信號檢測時的背景問題。在RCA?反應過程中未成環的鎖式探針和未結合探針的模板DNA?或者RNA?可能產生一些背景信號。

1.?3?滾環核酸擴增在畜牧生產中的應用

雖然可以通過一些方法部分克服RCA?的不足，但也進一步增加了反應成本，使得RCA?在動物疾病的臨床檢測中不適合被采用。

2?環介導等溫擴增

2.?1?環介導等溫擴增的原理

環介導等溫擴增其擴增原理是基于DNA?在65℃左右處于動態平衡狀態，任何一個引物向雙鏈DNA?的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈，在此前提下利用4?種不同的特異性引物識別靶基因的6?個特定區域，在鏈置換型DNA?聚合酶的作用下，以外側引物區段的3’末端為起點，與模板DNA?互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成[4]。

2.?2?環介導等溫擴增的優勢與不足

LAMP?的優勢：（1）擴增效率高，能夠在1h?內有效的擴增1-10?個拷貝的目的基因，擴增效率為普通PCR的10?倍-100?倍；（2）反應時間短，特異性強，不需要特殊的設備。

LAMP?的不足：（1）?對引物的要求特別高；（2）?擴增產物不能用于克隆

測序，只能用于判斷；（3）由于其敏感性強，特別容易形成氣溶膠，造成假陽性影響檢測結果。

2.?3?環介導等溫擴增技術在動物疾病檢測中的應用

LAMP?技術從誕生之日起就被認為是最有可能代替PCR?進行實驗室檢測的方法。2008?年Anne-Lie?B?等應用RT-LAMP建立了豬水皰病病毒(SVDV)的診斷方法[5]，該方法對血清樣本的敏感性相當于實時PCR，對糞便樣品的敏感性優于實時PCR。

3?鏈置換擴增

3.?1?鏈置換擴增的原理

鏈置換擴增其原理是基于在靶DNA?兩端帶有被化學修飾的限制性核酸內切酶識別序列，核酸內切酶在其識別位點將鏈DNA?打開缺口，DNA?聚合酶延伸缺口3’端并替換下一條DNA?鏈[6]。被替換下來的DNA?單鏈可與引物結合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復進行，使靶序列被高效擴增。SDA?的基本系統包括一種限制性核酸內切酶、一種具有鏈置換活性的DNA?聚合酶、兩對引物、dNTP?以及鈣、鎂離子和緩沖系統。

3.?2?鏈置換擴增技術的優勢與不足

SDA?的優點：（1）?擴增效率高，據Walker?等人的報道，采用SDA?擴增結核分枝桿菌總DNA?中的一段序列時，37℃反應2?小時后，可將靶序列擴增106?倍[7]；（2）反應時間短，特異性強，不需要特殊的設備。

SDA?的不足：（1）SDA?產物不均一。在SDA?循環中總要產生一些單、雙鏈產物，用電泳法檢測時必然要出現拖尾現象。（2）SDA?產物不可能直接用于克隆，測序和表達。使得SDA?在基因工程方面沒有優勢；（3）SDA?產物的檢測手段有待提高。目前SDA?產物檢測的主導方法是熒光偏振檢測，但該檢測方法需要特殊的檢測儀器----?熒光分光光度計，這限制了SDA?在臨床的廣泛應用。

3.?2?鏈置換擴增在動物疫病檢測中的應用

當前SDA?方法主要應用于分枝桿菌核酸定性檢測、病毒體外進化研究[23]和芯片雜交等方面，還沒有運用于動物疫病的檢測。

4?依賴核酸序列擴增

4.?1?依賴核酸序列擴增的原理

依賴核酸序列擴增(NASBA)是在PCR?基礎上發展起來的一種新技術。是由1?對帶有T7?啟動子序列的引物引導的連續、等溫、基于酶反應的核酸擴增技術，反應在41℃進行，可在2?h?內將模板RNA?擴增109?