軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)
軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實(shí)驗(yàn)(Anehorage-independentassay），利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質(zhì)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長。
軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。
細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，主要反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。
Part 01.
實(shí)驗(yàn)材料
細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、瓊脂糖、結(jié)晶紫
細(xì)胞培養(yǎng)板、微量離心管（EP管）、移液吸頭、移液槍
Part 02.
實(shí)驗(yàn)操作流程
1.提前配置1.2%和0.7%瓊脂（Agarose 加蒸餾水配置），高壓滅菌后4攝氏度冰箱保存。鋪板當(dāng)天微波爐或烘箱加熱融化，置于37攝氏度培養(yǎng)箱中。
2.鋪下層膠：按1：1比例混勻1.2%Agarose和20%1640，6孔板每孔取2毫升混合液，在室溫條件下等待冷卻凝固。
3.取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化配置成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為5*10^4/毫升。
4.鋪上層膠：按1：1比例使0.7%Agarose和20%1640培養(yǎng)基混勻，取2毫升混合液于EP管中，向管中加入10-20微升細(xì)胞懸液，充分混勻后加入已鋪下層膠的6孔板中，待上層瓊脂凝固后，放在37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，每三天向孔板中加入200微升培養(yǎng)基。
5.顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)克隆直徑并作圖。
常見問題與解答
Q：細(xì)胞密度為多少合適？
A：細(xì)胞接種密度與最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果密切相關(guān)，若細(xì)胞太多，形成克隆數(shù)目太多，處理結(jié)果時(shí)數(shù)克隆不僅容易出錯(cuò)，而且圖片很難看（下圖左）。細(xì)胞太少，不能形成克隆。如下圖所示：
上圖我們看到3株癌細(xì)胞在6孔板克隆形成圖片，第一個(gè)明顯鋪板細(xì)胞太密集，導(dǎo)致難以統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；中間那個(gè)正好，最后面那個(gè)細(xì)胞數(shù)量偏少，且細(xì)胞鋪板不均勻。因此，為了獲得美觀的圖片和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，第一次實(shí)驗(yàn)最好設(shè)置細(xì)胞接種梯度，如500-1000-2000-5000個(gè)/孔挑選出最合適的接種密度。細(xì)胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)要求有95%以上的分散度，否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)受到很大影響；另外注意細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)建議多計(jì)數(shù)幾次。
Q：細(xì)胞接種后培養(yǎng)的時(shí)間，如何確定？
A：通常情況下，單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上所組成的細(xì)胞群稱為一個(gè)陽性克隆，時(shí)間約為一周；但具體時(shí)間因細(xì)胞增殖能力而已異，因此應(yīng)密切關(guān)注細(xì)胞生長情況，隔天在顯微鏡下觀察克隆情況，若單個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)到達(dá)50個(gè)左右即可固定細(xì)胞。
Q：細(xì)胞鋪板均勻的重要性
A：若鋪板不均勻，細(xì)胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并且拍出的圖片不美觀。
Q：細(xì)胞未形成克隆的原因？
A：并非每種細(xì)胞都可以形成克隆，克隆形成率與細(xì)胞本身增殖能力有關(guān)。還與接種細(xì)胞密度，加入培養(yǎng)液的體積、血清濃度有關(guān)。因該實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間較長，應(yīng)給細(xì)胞多加培養(yǎng)基，如每孔4ml，或者3天更換一次培養(yǎng)基，以供給細(xì)胞充足的營養(yǎng)。
Q：計(jì)數(shù)時(shí)克隆數(shù)目較多，有什么快捷辦法？
A：只要細(xì)胞鋪板均勻，我們可以選擇分區(qū)計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。
注意事項(xiàng)
1.細(xì)胞一定要吹打分散成單細(xì)胞懸液
2.接種時(shí)細(xì)胞密度不可過高
3.軟瓊脂與細(xì)胞混合時(shí)溫度不可過高，容易燙傷甚至燙死細(xì)胞。
4.軟瓊脂對(duì)熱和酸不穩(wěn)定，反復(fù)加熱容易降解并產(chǎn)生毒性，且容易造成硬度下降，因此需要高壓滅菌后進(jìn)行分裝。
5.鋪板操作時(shí)速度要快，以免造成局部凝固。