-80℃保存，一年有效。-20℃保存，1-2個月內有效。4℃保存，一周內有效。

反復凍融會降低病毒滴度，如有必要請在收到本產品后分裝保存。分裝時必須在冰浴上進行。病毒融解后，如果在一周內使用，可以放于4℃，但須注意4℃存放時間越長，滴度下降越明顯。如果-80℃保存時間超過一年，可能會導致滴度下降，此時建議重新測定病毒滴度。

本產品使用前請仔細閱讀附錄1《慢病毒使用安全規范》。本產品生物安全等級為Biosafety Level 2 (BSL-2)，在按照常規的微生物實驗操作要求進行操作(Standard microbiological practices)的基礎上，還需要注意限制接觸、生物危害提示、顯著的警示標識、并制定相應的安全規范。

病毒操作中應注意有效防護，絕對禁止在生物安全柜內有任何皮膚直接暴露的情況。實驗完成后，請及時清洗雙手。嚴禁直接接觸病毒，如意外接觸，請及時用清水沖洗，并適當用70%乙醇對皮膚進行消毒。

任何接觸過病毒的材料、試劑、樣品，應經消毒處理，可以采用1%的SDS溶液、或84消毒液(1:20)浸泡30分鐘以上，或121℃高壓滅菌30分鐘。

本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

Lenti-CMV-CD9-EGFP，即Lentivirus expressing CD9-EGFP fusion protein，是碧云天自行研發的一種可以在大多數哺乳動物細胞(包括原代細胞和干細胞)中通過CMV啟動子表達人源CD9-EGFP融合蛋白的重組慢病毒。本產品可用于外泌體的示蹤研究，用于研究外泌體的形成、分泌、靶向和運輸機制。本產品帶有嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因，感染細胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩定株。

外泌體(Exosome)是膜包裹的細胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直徑約為40-160nm，具有脂質雙分子層結構，天然存在于血液、尿液、腦脊液，以及體外培養細胞的上清液中[1]，幾乎所有類型的細胞都可以產生并釋放外泌體[2]。如圖1所示，細胞膜內吞(Endocytosis)依次形成初級內體(Early sorting endosome, ESE)、次級內體(Late sorting endosome, LSE)和多囊泡體(Multivesicular body, MVB)，其中多囊泡體包含腔內囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs)。多囊泡體與細胞膜融合形成外泌體，外泌體攜帶多種來自其母體細胞的成分(包括核酸、蛋白質、脂類和代謝物等)釋放到胞外基質中[3]。外泌體可以被附近或遠距離的細胞識別和融合，是細胞間進行相互調控的重要媒介，參與了癌癥、神經退行性病變和炎癥性疾病等多種疾病的發病過程，影響細胞多方面的功能[4-5]。

圖1. 外泌體的形成原理及其攜帶的母體細胞成分示意圖。

外泌體標志蛋白(Protein biomarkers for exosome)，也稱外泌體蛋白標志物(Protein markers for exosome)，可以用于鑒定、觀察、標記和純化外泌體。據外泌體據庫統計來自不同生物、細胞類型和體液的外泌體中已發現9769種蛋白質，ExoCarta列出了100種常見外泌體蛋白標志物，其中CD9、CD63、CD81、Alix、Flotillin、Ceramide和Tumor susceptibility gene 101 (TSG101)是最常用的外泌體蛋白標志物(如圖2所示[3])。CD9在人體中由CD9基因編碼的蛋白質抗原，是跨膜四超家族(Transmembrane 4 superfamily)成員之一，為4次跨膜蛋白，大量存在于細胞外囊泡的表面，也會出現在普通的細胞膜表面。CD9是最常用的外泌體蛋白標志物之一，可以調節細胞黏附和遷移，同時還可以觸發血小板活化和聚集，被認為是血小板活化標志物[6]。

圖2. 常見的外泌體蛋白標志物示意圖。

Lenti-CMV-CD9-EGFP感染HEK293T細胞后的表達效果如圖3所示。

圖3. 碧云天生產的Lenti-CMV-CD9-EGFP (C4007)感染HEK293T細胞的效果圖。96孔板每孔10,000個細胞，培養過夜后用相應的病毒TU數進行感染，病毒感染72小時后熒光顯微鏡實拍相同大小視野效果圖。實際檢測效果會因檢測儀器、實驗條件的不同而存在差異，本圖僅供參考。

慢病毒感染細胞后會將目的基因隨機整合到基因組DNA上，因而可以長期穩定地表達目的蛋白，并且幾乎可以感染所有哺乳動物細胞，在很多不分裂的細胞中也可以長期穩定表達，廣泛應用于細胞和動物實驗。

本產品表達嘌呤霉素抗性基因，因此本產品感染培養的細胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩定表達的細胞株以用于后續研究。

碧云天的Lenti-CMV-CD9-EGFP是復制缺陷型慢病毒。其3' LTR的增強子功能發生缺失，形成了自失活(Self-inactivating) 3' LTR，并且5' LRT中的U3區域替換成CMV啟動子，在感染普通的細胞后不能進行復制和擴增，從而有效降低了本產品在活體生物中的風險。

碧云天推薦的慢病毒感染不同種類體外培養細胞的MOI值參見下表。

實驗室常用的逆轉錄病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺相關病毒(AAV)和腺病毒(Adenovirus)的主要特征之間的比較和差別參見下表。具體的特定病毒的一些特征和下表相比可能會有一定差異。

本產品的滴度不低于10^9TU/ml，適合細胞實驗或活體動物實驗。TU, transduction unit，即轉導單位。TU通過本產品梯度稀釋后感染HEK293T細胞后測定獲得，能讓一個HEK293T細胞呈現綠色熒光的活力單位定義為1TU。MOI (Multiplicity of Infection)是病毒感染細胞時，病毒數量與細胞數量的比值。使用10^9TU/ml的本產品，如果按照5 MOI感染6孔板的細胞，每孔50萬細胞計算，100μl共可以感染40個孔；如果按照5 MOI感染24孔板的細胞，每孔10萬細胞計算，100μl共可以感染200個孔。如果MOI值提高，相應可以感染的孔數會減少；如果MOI值下調，相應可以感染的孔數會增加。