?CatchPoint cAMP熒光檢測試劑盒應用方案解析
介紹
本研究展示了如何在 SpectraMax? i3多功能酶標儀中應用CatchPoint? cAMP熒光試劑盒監測腺苷酸環化酶激活劑forskolin對HEK293細胞的影響(如圖1)。
G蛋白偶聯受體(GPCRs)是重要的跨膜蛋白，能將胞外信號傳導入胞內，引起信號逐級放大的級聯反應，導致胞內某些蛋白活性或表達的改變[1]。3’, 5’-單磷酸化環腺苷(cAMP)作為第二信使參與GPCR活化后的下游反應。當胞外配體作用于GPCR時，GPCR構象發生改變，激活胞內連接的G蛋白。接下來的信號傳導路徑與被激活的G蛋白類型有關。其中當Gs蛋白被激活時，會導致腺苷酸環化酶活化引起的胞內cAMP濃度上調，進一步激活蛋白激酶A，最終促進一些目標蛋白的磷酸化，這些目標蛋白可能參與了例如多巴胺神經信號傳導、葡萄糖再生反應、血管擴張、細胞有絲分裂、卵子成熟等重要生理生化過程[2-6]。
CatchPoint? cAMP熒光檢測試劑盒采用免疫競爭原理測得cAMP濃度(如圖2)，僅需一步洗脫，且反應底物加入后短可放置10分鐘，長可延至24小時后再檢測，信號穩定靈敏。
優勢
? 通過檢測cAMP濃度準確衡量GPCR活性
? 只需一步洗脫
? 信號穩定(10分鐘-24小時)
? Z 因子為0.91
材料
·???????? CatchPoint cAMP熒光檢測試劑盒(Molecular Devices ，貨號R8088)
·???????? HEK293細胞 (ATCC 編號CRL-1573)
·???????? KRGB緩沖液 (Sigma，貨號K4002)
·???????? 碳酸氫鈉 (Sigma，貨號S5761)
·???????? PBS緩沖液 (Life Technologies，貨號10010)
·???????? 磷酸二酯酶抑制劑，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，
·???????? IBMX (Sigma，貨號17018)
·???????? 30%過氧化氫溶液
·???????? MEM培養基 (Corning，貨號10-010)
·???????? 胎牛血清 (Gemini Bio-Products，貨號100-106)
·???????? 青霉素 (Life Technologies，貨號15070-063)
·???????? Forskolin (Sigma，貨號F6886)
·???????? 多聚-D-賴氨酸包被96孔板 (Corning，貨號354413)
·???????? SpectraMax? i3多功能酶標儀
·???????? SpectraMax? MiniMax? 300細胞成像系統
·???????? MultiWash+? 洗板機
方法
H E K 2 9 3 細胞培養于全生長培養基(MEM+10%FBS+1%青霉素/鏈霉素)中， 鋪滿T 75培養瓶瓶底8 0 - 9 0 %。0.05%胰酶消化后收集細胞，按照25000個/孔的密度接種到96孔板中(多聚-D-賴氨酸包被，黑壁底透)，接種密度可在25000-100000 個/ 孔范圍， 3 7 ℃、5%CO2環境下細胞貼壁培養至少18h。
熒光檢測前，先用SpectraMax? MiniMax?300細胞成像系統透射光通道觀察細胞，以掌握其生長飽和情況，并應用Stain-Free?無標記細胞計數法準確測量細胞數目或覆蓋面積百分比(即飽和度)，以達到質量控制的目的(如圖3)。細胞飽和度高且孔間差異小的行被挑選進行CatchPoint檢測。室溫下先用0.75mM IBMX預作用細胞10分鐘，然后37°C下用系列濃度梯度的forskolin(起始孔濃度1000nM，其他孔按1:3依次稀釋)處理細胞15分鐘。藥物處理后按照CatchPoint檢測試劑盒說明書裂解各孔細胞。
接下來按照產品說明書進行操作檢測。cAMP標準樣品檢測得到一條標準曲線，以確認試劑盒功能是否正常，并可通過該擬合方程式計算出細胞樣品中cAMP濃度。過程中洗脫步驟使用MultiWash+洗板機。紅色底物StopLight加入樣品30分鐘后用SpectraMax? i3多功能酶標儀讀數。SoftMax? Pro軟件執行所有數據采集、分析和曲線擬合功能，另外還在模板庫中提供了專門的CatchPoint cAMP檢測試劑盒預設模板。
結果
在藥物刺激前需掌握細胞飽和度情況，該實驗中采用了M i n i m a x 成像系統以及StainFree無標記技術檢測各孔中細胞覆蓋面積百分比(如圖3)。根據檢測結果，A行和C行因為不同孔間均一的細胞生長飽和度被選作待測樣品行。各處理孔提取出細胞裂解后的樣品進行檢測。
圖4和5分別顯示了cAMP標準曲線和細胞樣品藥物濃度響應曲線，兩條曲線均用4參數擬合。標準曲線得到EC50 =3.3 nM，該值與已發表數據一致[7]，其中Z因子為0.91。Forskolin濃度響應曲線測得EC50=2.3 nM，該值符合根據HEK293細胞貼壁情況推導的結論。
結論
CatchPoint? cAMP熒光檢測試劑盒能通過測量cAMP濃度準確衡量GPCR活性，檢測信號極穩定(可維持10分鐘-24小時)，優異的Z因子值，應用酶標儀熒光強度功能進行CatchPoint cAMP檢測成為高通量藥物篩選的可靠選擇。
參考文獻
1. Zaccolo, Manuela. “cAMP signal transduction in the heart: understanding spatial control for the development of novel therapeutic strategies.” British Journal of Pharmacology 158.1 (2009): 50-60.
2. Hanoune, Jacques, and Nicole Defer. “Regulation and role of adenylyl cyclase isoforms.”
Annual Review of Pharmacology and Toxicology 41.1 (2001): 145-174.
3. Griendling, Kathy K., et al. “Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology.” Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 20.10 (2000): 2175-2183.
4. Kemp, Bruce E., et al. “Dealing with energy demand: the AMP-activated protein kinase.” Trends in Biochemical Sciences 24.1 (1999): 22-25.
5. Etgen, Anne M., Michael A. Ansonoff, and Arnulfo Quesada. “Mechanisms of ovarian steroid regulation of norepinephrine receptor-mediated signal transduction in the hypothalamus: implications for female reproductive physiology.” Hormones and Behavior 40.2 (2001): 169-177.
6. Chini, Eduardo N., et al. “Adrenomedullin suppresses mitogenesis in rat mesangial cells via cAMP pathway.” Biochemical and Biophysical Research Communications 215.3 (1995): 868-873.
7. Hesley, Jayne, Janet Daijo, and Anne T. Ferguson. “Stable, sensitive, fluorescence-based method for detecting cAMP.” BioTechniques 33.3 (2002): 692-694.