紅霉素(Erythromycin)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
1?使用目的：
本試劑盒用于飼料、魚、蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣中紅霉素(Erythromycin)殘留的定量檢測。
2?實驗原理
本試劑盒采用競爭ELISA方法，在微孔板包被有紅霉素(Erythromycin)偶聯抗原，加入紅霉素(Erythromycin)標準品或樣品，游離紅霉素(Erythromycin)與微孔條上預包被的紅霉素(Erythromycin)偶聯抗原互相競爭抗紅霉素(Erythromycin)抗體酶標記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍色變為黃色，用酶標儀在450nm波長下進行檢測，吸光值與樣品中紅霉素(Erythromycin)含量成反比，通過標準曲線計算樣品中紅霉素(Erythromycin)的含量。??
3?試劑盒組成?
3.1?預包被的紅霉素(Erythromycin)偶聯抗原的可拆酶標板：1塊（12孔×8條）。
3.2紅霉素(Erythromycin)標準品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是：0?ppb,?5?ppb,15?ppb,45?ppb,135?ppb,405ppb
3.3抗磺胺嘧啶(SD)抗體酶結合物：1瓶（6ml）。
3.4顯色液A：1瓶（6ml）。
3.5顯色液B：1瓶（6ml）。
3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7樣本稀釋液：1瓶（10×,??6ml），用于樣品稀釋用。
3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9說明書一份。
4?需要而未提供的材料
4.1?設備
4.1.1波長450nm酶標儀。?
4.1.2粉碎機。
4.1.3量筒。
4.1.4振蕩器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman?No?1或相當的濾紙。
4.1.7微量移液器。
4.2?試劑
4.2.1去離子水或蒸餾水。
4.2.2?甲醇。
5?貯存
5.1?試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍
5.2?未用完的微孔板應該密封干燥保存
6?注意事項
6.1?使用試劑盒前請仔細閱讀說明書。
6.2?不要使用過期試劑盒。
6.3?試劑盒使用前，將試劑恢復至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時。
6.4?標準品中含有紅霉素(Erythromycin)，使用時應特別注意，操作時應帶手套。
6.5?終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。
6.6?不同標準品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗結果。
6.7?不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標準品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響實驗結果。
6.8?稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會影響實驗結果
6.9?混合試劑時應避免起泡。
7?工作液準備
7.1紅霉素(Erythromycin)標準品溶液：0?ppb,?5?ppb,15?ppb,45?ppb,135?ppb,405ppb
7.2?濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用
7.3?樣本稀釋液：備用
7.3?顯色劑：已備用，避免光線直照
7.4?反應終止液：已備用
8?樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴格按說明書操作，提取過程中應準確稀釋，否則會出現結果不準確，樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存）
8.1取10g粉碎的樣品，加?20ml?70%甲醇溶液
8.2強力振蕩3分鐘
8.3用Whatman?No?1濾紙過濾
8.4取100μl處理后的樣品，加入400μl樣本稀釋液
8.5取50μl稀釋液進行分析（稀釋倍數10）
9?酶免分析步驟
9.1?實驗須知
9.1.1?實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復至室溫（25±2℃），時間約2小時?；販刂潦覝兀?/FONT>25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準確度。
9.1.2?使用后請立即將試劑放回2~8℃保存
9.1.3?請不要改變分析程序
9.1.4?請使用精確的微量移液器
9.1.5?操作一旦開始，請不要中斷任何程序
9.1.6?ELISA結果的可重復性極大程度的取決于操作程序，請嚴格按照要求操作
9.1.7?為避免交叉污染，每個標準品和樣品均應使用不同的吸頭加樣
9.1.8?加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內表面
9.2?分析步驟
9.2.1?預先進行編號，標記B0、標準品和樣品的位置，推薦進行雙孔檢測
9.2.2?取所需數量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3?樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（10×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)
9.2.4?在B0孔中加入50μl0.0?ppb標準品溶液
9.2.5?在各標準孔中加入50μl的標準品溶液
9.2.6?在各樣品孔中加入50μl樣品溶液
9.2.7?在所有孔中加入50μl的抗紅霉素(Erythromycin)抗體酶結合物
9.2.8?輕輕晃動反應板幾秒鐘。?
9.3?37℃溫浴30min?（溫浴過程中不時輕拍反應板，可以減少雙孔誤差）
9.3.1?甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，最后一次應在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。
9.4?反應
9.4.1?洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50μl顯色液A，再加?50μl顯色液B；輕微晃動反應板使之徹底混勻
9.4.2?37℃溫浴10min
9.4.3?每孔中加入50μl終止液，混勻
9.4.4?在450nm下檢測吸光度，結果在5min內讀取。
10?結果計算
10.1定量分析
10.1.1所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0?ppb標準溶液的平均吸光度值
10.1.2以紅霉素(Erythromycin)濃度的對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。根據樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應點的橫坐標，即為紅霉素(Erythromycin)濃度的對數值，求得反對數即為測定液中紅霉素(Erythromycin)濃度C（ppb）
10.1.3由于樣品經過了預先稀釋，因此根據標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。?
10.2?半定量測定
10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當的標準液與樣品同運行，根據樣品與標準品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。
10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當的標準液與樣品同運行，根據樣品與標準品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。
11?特異性
物質?交叉反應
紅霉素(Erythromycin)?100%
12?試劑盒參數
本試劑盒檢測下限為5ppb
B0吸光度最佳值應大于1.0
試劑盒吸光度板內誤差小于8％，板間誤差小于15％。
用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。
13?標準曲線模式（僅供參考）
試劑盒提供的標準曲線范圍為5ppb~405ppb。
14?分析限制
本試劑盒檢測為陽性的樣品應該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。
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