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本產品僅供科學研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！
肉毒堿棕櫚酰轉移酶（CPT-1）試劑盒說明書
規格：100 管/96 樣
正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：
微量法
肉毒堿棕櫚酰轉移酶是存在于線粒體內膜的一類酰基轉移酶。可逆地催化從?；o酶A 將酰
基轉移至L-肉毒堿的反應，在轉運脂肪酸通過線粒體內膜的過程中起重要作用。
測定原理：
基于肉堿和脂酰輔酶A 在丙二酰輔酶A 存在與否的條件下，通過肉堿脂酰轉移酶(CPT-I)的作
用，產生脂酰肉堿，并釋放出巰基輔酶A(COA-SH)，與Ellman 試劑DN-TB 反應后，產生黃
色的TNB。通過其吸收峰值得變化（412nm），來定量分析CPT-1 的活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1 瓶，
-20℃保存；試
劑二：液體20mL×1
瓶，-20℃保存；
試
劑三：液體1.5mL×1
支，-20℃保存；
試
劑四：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；試試劑
五：粉劑×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
①
稱取約0.1g 組織或收集500 萬細胞，加入1mL 試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或
研缽勻漿。
②
將勻漿液于600g，4℃離心5min。
③
棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④
上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的CPT-1（此步可選做）。
⑤
在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或
200W，超聲3 秒，間隔10 秒，重復30 次），用于線粒體CPT-1 測定。
測定步驟：
1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 412nm，蒸餾水調零。
2、樣本測定
（1） 在試劑五中加入1mL 無水乙醇，混勻，再加入22mL 試劑四，混勻，37℃（哺乳動物） 或
25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；本產品僅供科學研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！
（2） 在試劑六中加入 1mL 蒸餾水，混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育5min； 用
不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
（3） 在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 樣本、220μL 試劑五和10μL 試劑六，混勻，記
錄412nm 處20 秒時的初始吸光度A1 和2 分20 秒時的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。
CPT-1 活性計算：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1 nmol TNB
定義為一個酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V
樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g
組織每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/g
鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=177.8×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。CPT- 1
（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.3556×ΔA V 反總：
反應體系總體積，2.4×10-4L；ε：TNB 摩爾消光系數，1.36×104L / mol /cm；d：比色皿光徑，
1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，2min；
Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數， 500 萬。
b. 使用96 孔板測定的計算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1 nmol TNB
定義為一個酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V
樣×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g
組織每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/g
鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T=355.6×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1 nmol TNB
定義為一個酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V
樣÷V 樣總）÷T=0.711×ΔA
V 反總：反應體系總體積，2.4×10-4L；ε：TNB 摩爾消光系數，1.36×104 L / mol /cm；d：96
孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；
T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌
總數，500 萬。