細(xì)胞療法發(fā)展的一個主要挑戰(zhàn)是在生產(chǎn)和生物工藝階段確立產(chǎn)品功效和持久性的質(zhì)量指標(biāo)。在臨床前對產(chǎn)品適用性進(jìn)行表征至關(guān)重要，但事實上這項工作極具挑戰(zhàn)性，因為目前的技術(shù)只提供細(xì)胞功能的間接測量。優(yōu)化細(xì)胞治療生物工藝，改善治療效果，需要在單細(xì)胞水平上進(jìn)行細(xì)胞因子分析以表征細(xì)胞治療產(chǎn)品的功能。
IsoPlexis的IsoCode單細(xì)胞分泌組解決方案可以直接識別單個細(xì)胞分泌的一系列細(xì)胞因子，使研究人員對細(xì)胞功能有獨特的見解。這使得高度多功能細(xì)胞（highly polyfunctional cells）的發(fā)現(xiàn)成為可能，“多功能細(xì)胞”是指可同時分泌多種細(xì)胞因子來執(zhí)行多種功能的細(xì)胞群體，與細(xì)胞治療產(chǎn)品的免疫活性和臨床反應(yīng)有關(guān)。
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以下案例將展示如何借助IsoPlexis單細(xì)胞CAR-T解決方案為研究人員開發(fā)有效而持久的細(xì)胞療法。
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將多功能性作為細(xì)胞治療產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性
在最近發(fā)表在《Nature Medicine》上的一項研究中，美國斯坦福大學(xué)研究人員Spiegel等人利用IsoPlexis平臺揭示一種優(yōu)化生產(chǎn)工藝的新方式，用于一種新型的CD19和CD22雙靶點CAR-T產(chǎn)品（CD19-22.BB.z）的生產(chǎn)優(yōu)化。在一項評估復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞惡性腫瘤治療的一期臨床試驗中，IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)為預(yù)測CAR-T在體內(nèi)的療效提供了有意義的產(chǎn)品質(zhì)量見解。
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臨床試驗數(shù)據(jù)表明使用CD19-22.BB-CAR治療大B細(xì)胞淋巴瘤（LBCL）后疾病進(jìn)展與強大的早期應(yīng)答及隨后的早期獲得性耐藥性有關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)了復(fù)發(fā)的一個功能驅(qū)動因素，這表明CAR-T生產(chǎn)的改進(jìn)有可能防止抗原逃逸相關(guān)的耐藥性。
研究人員發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞產(chǎn)生的功能蛋白是預(yù)測CAR-T細(xì)胞療法效力的一個有意義的屬性。
作者評價：“我們的結(jié)果表明，在基因編輯的CAR-T產(chǎn)品迭代中應(yīng)借助單細(xì)胞CAR-T細(xì)胞多功能性謹(jǐn)慎評估，將細(xì)胞因子產(chǎn)生的多功能性作為一個關(guān)鍵的質(zhì)量屬性來指導(dǎo)工作開展。”
該文章強調(diào)了IsoPlexis如何為CAR-T療法的產(chǎn)品表征、優(yōu)化以及生產(chǎn)流程提供關(guān)鍵的預(yù)測指標(biāo)。
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CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝優(yōu)化
隨著CAR-T臨床應(yīng)用的擴大，自動化、全封閉細(xì)胞制造系統(tǒng)正在逐漸取代傳統(tǒng)的勞動密集型、開放式培養(yǎng)方法。以下案例介紹采用全封閉自動化CliniMACS Prodigy設(shè)備對不同工藝程序生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行功能評估，以選擇合適的工藝。
Case 1：
比較兩種生產(chǎn)雙特異性CD19 22 CAR-T細(xì)胞的自動化工藝
原始方法（OM）：即最初的方法，采用TransAct CD3/CD28試劑介導(dǎo)T細(xì)胞激活/刺激，然后進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，在第5天結(jié)束洗滌步驟。
改良方法（MM）：采用TransAct CD3 / CD28試劑介導(dǎo)T細(xì)胞激活/刺激，然后進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，在第3天結(jié)束洗滌步驟。
在OM運行中（T細(xì)胞的刺激和激活時間更長），有些更敏感的病人細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞活力和擴增減弱。
一共對4例單采樣本進(jìn)行了評估，比較MM和OM方法生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品差異。除了終止洗滌的時間外，其他工藝保持不變。在培養(yǎng)7-12天之間收獲細(xì)胞，以保證達(dá)到細(xì)胞數(shù)目要求。
采用流式檢測CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及細(xì)胞免疫表型。對于細(xì)胞功能評估，則采用IsoCode單細(xì)胞分泌蛋白組技術(shù)分析抗原特異性多功能細(xì)胞因子的表達(dá)。
CAR-T生產(chǎn)及檢測流程圖
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數(shù)據(jù)顯示，與原有OM方法相比，MM改良法可促進(jìn)CD4或CD8 CAR - T細(xì)胞產(chǎn)物對CD19或CD22的多功能性反應(yīng)。而且，在對配對的多例病人樣本進(jìn)行單獨分析時，這些結(jié)果表現(xiàn)出一致性。因此，最終采用MM法進(jìn)行臨床級別的CD19/CD22雙特異性CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)。
Case 2：
在CAR-T生產(chǎn)中選擇更優(yōu)的IL-7制劑
IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)解決方案使研究人員能夠通過測量細(xì)胞外功能對單個免疫細(xì)胞進(jìn)行表型分析，為細(xì)胞治療性能提供預(yù)測性的質(zhì)量見解。
在新近發(fā)表在《Nature Communications》上的一項研究中，來自圣路易斯華盛頓大學(xué)的Kim等研究人員的工作重點在于比較重組人IL-7與Fc融合蛋白 （rhIL-7- hyFc）是否像rhIL-7一樣增強CAR-T細(xì)胞的功能活性，而后者已在臨床試驗中使用，并顯示其耐受性良好，可顯著增加人體的T細(xì)胞數(shù)量。若是如此，這種長效作用的rhIL-7-hyFc的方便性將使其成為進(jìn)入人體臨床研究的首選藥物。
結(jié)果顯示，盡管rhIL-7- hyFc可介導(dǎo)強大的UCART19細(xì)胞擴增，但并未發(fā)現(xiàn)任何功能上的損失（通過PSI定義）。從實驗第0天開始，rhIL-7- hyFc擴增的UCART19細(xì)胞保持了與UCART19細(xì)胞相似的細(xì)胞因子分泌譜和PSI。
這些數(shù)據(jù)證實了rhIL-7-hyFc不僅可增強功能性UCART19細(xì)胞的體外擴增，并維持了CAR-T細(xì)胞的多功能性。
IsoPlexis單細(xì)胞細(xì)胞因子分析結(jié)果也支持小鼠動物模型體內(nèi)結(jié)論，即rhIL-7-hyFc促進(jìn)人CAR-T細(xì)胞在CD19+荷瘤NSG小鼠中的持久性，增強抗腫瘤功效，從而延長無瘤生存時間。因此，rhIL-7-hyFc是一種可調(diào)的臨床即用佐劑，以改善CAR-T細(xì)胞的功能活性。
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Case 3：
采用可定制規(guī)模的攪拌式生物反應(yīng)器實現(xiàn)異基因T細(xì)胞治療
為了評估T細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中擴增后的功能狀態(tài)，研究人員評估了T細(xì)胞在刺激后產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。第0天和第14天獲得的T細(xì)胞樣本中分離CD4+和CD8+ T細(xì)胞，純度為98%。
數(shù)據(jù)顯示，在經(jīng)過攪拌式生物反應(yīng)器擴增后，T細(xì)胞依然保持較高的多功能性，尤其CD8細(xì)胞的多功能性顯著提高。
與第0天相比，第14天的樣本顯示產(chǎn)生5種以上細(xì)胞因子的T細(xì)胞數(shù)量增加。即使頻率較低，第14天T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類最多，CD4+ T細(xì)胞可產(chǎn)生11種細(xì)胞因子，CD8+ T細(xì)胞可產(chǎn)生9種細(xì)胞因子。
此外，基于細(xì)胞因子特征的細(xì)胞類型分類表明，在保留刺激特征的同時，效應(yīng)因子的多功能強度指數(shù)增加。
參考文獻(xiàn)：
- Spiegel JY, Patel S, Muffly L, et. al. CAR T cells with dual targeting of CD19 and CD22 in adult patients with recurrent or refractory B cell malignancies: a phase 1 trial. Nat Med. 2021 Aug;27(8):1419-1431.
- Kim MY, Jayasinghe R, Devenport JM, et. al. A long-acting interleukin-7, rhIL-7-hyFc, enhances CAR T cell expansion, persistence, and anti-tumor activity. Nat Commun. 2022 Jun 13;13(1):3296.
- Gatla H, Uth N, Levinson Y, et. al. Enabling Allogeneic T Cell-Based Therapies: Scalable Stirred-Tank Bioreactor Mediated Manufacturing. Front Med Technol. 2022 May 30;4:850565.