細胞療法發展的一個主要挑戰是在生產和生物工藝階段確立產品功效和持久性的質量指標。在臨床前對產品適用性進行表征至關重要，但事實上這項工作極具挑戰性，因為目前的技術只提供細胞功能的間接測量。優化細胞治療生物工藝，改善治療效果，需要在單細胞水平上進行細胞因子分析以表征細胞治療產品的功能。

IsoPlexis的IsoCode單細胞分泌組解決方案可以直接識別單個細胞分泌的一系列細胞因子，使研究人員對細胞功能有獨特的見解。這使得高度多功能細胞（highly polyfunctional cells）的發現成為可能，“多功能細胞”是指可同時分泌多種細胞因子來執行多種功能的細胞群體，與細胞治療產品的免疫活性和臨床反應有關。

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以下案例將展示如何借助IsoPlexis單細胞CAR-T解決方案為研究人員開發有效而持久的細胞療法。

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將多功能性作為細胞治療產品的關鍵質量屬性

在最近發表在《Nature Medicine》上的一項研究中，美國斯坦福大學研究人員Spiegel等人利用IsoPlexis平臺揭示一種優化生產工藝的新方式，用于一種新型的CD19和CD22雙靶點CAR-T產品（CD19-22.BB.z）的生產優化。在一項評估復發或難治性B細胞惡性腫瘤治療的一期臨床試驗中，IsoPlexis單細胞功能蛋白質組學為預測CAR-T在體內的療效提供了有意義的產品質量見解。

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臨床試驗數據表明使用CD19-22.BB-CAR治療大B細胞淋巴瘤（LBCL）后疾病進展與強大的早期應答及隨后的早期獲得性耐藥性有關。研究人員發現了復發的一個功能驅動因素，這表明CAR-T生產的改進有可能防止抗原逃逸相關的耐藥性。

研究人員發現，單細胞產生的功能蛋白是預測CAR-T細胞療法效力的一個有意義的屬性。

作者評價：“我們的結果表明，在基因編輯的CAR-T產品迭代中應借助單細胞CAR-T細胞多功能性謹慎評估，將細胞因子產生的多功能性作為一個關鍵的質量屬性來指導工作開展。”

該文章強調了IsoPlexis如何為CAR-T療法的產品表征、優化以及生產流程提供關鍵的預測指標。

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CAR-T產品的生產工藝優化

隨著CAR-T臨床應用的擴大，自動化、全封閉細胞制造系統正在逐漸取代傳統的勞動密集型、開放式培養方法。以下案例介紹采用全封閉自動化CliniMACS Prodigy設備對不同工藝程序生產的CAR-T細胞進行功能評估，以選擇合適的工藝。

Case 1：

比較兩種生產雙特異性CD19 22 CAR-T細胞的自動化工藝

原始方法（OM）：即最初的方法，采用TransAct CD3/CD28試劑介導T細胞激活/刺激，然后進行慢病毒轉導，在第5天結束洗滌步驟。

改良方法（MM）：采用TransAct CD3 / CD28試劑介導T細胞激活/刺激，然后進行慢病毒轉導，在第3天結束洗滌步驟。

在OM運行中（T細胞的刺激和激活時間更長），有些更敏感的病人細胞出現細胞活力和擴增減弱。

一共對4例單采樣本進行了評估，比較MM和OM方法生產的CAR-T細胞產品差異。除了終止洗滌的時間外，其他工藝保持不變。在培養7-12天之間收獲細胞，以保證達到細胞數目要求。

采用流式檢測CAR轉導效率及細胞免疫表型。對于細胞功能評估，則采用IsoCode單細胞分泌蛋白組技術分析抗原特異性多功能細胞因子的表達。

CAR-T生產及檢測流程圖

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數據顯示，與原有OM方法相比，MM改良法可促進CD4或CD8 CAR - T細胞產物對CD19或CD22的多功能性反應。而且，在對配對的多例病人樣本進行單獨分析時，這些結果表現出一致性。因此，最終采用MM法進行臨床級別的CD19/CD22雙特異性CAR-T細胞生產。

Case 2：

在CAR-T生產中選擇更優的IL-7制劑

IsoPlexis單細胞功能蛋白質組學解決方案使研究人員能夠通過測量細胞外功能對單個免疫細胞進行表型分析，為細胞治療性能提供預測性的質量見解。

在新近發表在《Nature Communications》上的一項研究中，來自圣路易斯華盛頓大學的Kim等研究人員的工作重點在于比較重組人IL-7與Fc融合蛋白 （rhIL-7- hyFc）是否像rhIL-7一樣增強CAR-T細胞的功能活性，而后者已在臨床試驗中使用，并顯示其耐受性良好，可顯著增加人體的T細胞數量。若是如此，這種長效作用的rhIL-7-hyFc的方便性將使其成為進入人體臨床研究的首選藥物。

結果顯示，盡管rhIL-7- hyFc可介導強大的UCART19細胞擴增，但并未發現任何功能上的損失（通過PSI定義）。從實驗第0天開始，rhIL-7- hyFc擴增的UCART19細胞保持了與UCART19細胞相似的細胞因子分泌譜和PSI。

這些數據證實了rhIL-7-hyFc不僅可增強功能性UCART19細胞的體外擴增，并維持了CAR-T細胞的多功能性。

IsoPlexis單細胞細胞因子分析結果也支持小鼠動物模型體內結論，即rhIL-7-hyFc促進人CAR-T細胞在CD19+荷瘤NSG小鼠中的持久性，增強抗腫瘤功效，從而延長無瘤生存時間。因此，rhIL-7-hyFc是一種可調的臨床即用佐劑，以改善CAR-T細胞的功能活性。

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Case 3：

采用可定制規模的攪拌式生物反應器實現異基因T細胞治療

為了評估T細胞在攪拌式生物反應器中擴增后的功能狀態，研究人員評估了T細胞在刺激后產生細胞因子的能力。第0天和第14天獲得的T細胞樣本中分離CD4+和CD8+ T細胞，純度為98%。

數據顯示，在經過攪拌式生物反應器擴增后，T細胞依然保持較高的多功能性，尤其CD8細胞的多功能性顯著提高。

與第0天相比，第14天的樣本顯示產生5種以上細胞因子的T細胞數量增加。即使頻率較低，第14天T細胞產生的細胞因子種類最多，CD4+ T細胞可產生11種細胞因子，CD8+ T細胞可產生9種細胞因子。

此外，基于細胞因子特征的細胞類型分類表明，在保留刺激特征的同時，效應因子的多功能強度指數增加。

參考文獻：

• Spiegel JY, Patel S, Muffly L, et. al. CAR T cells with dual targeting of CD19 and CD22 in adult patients with recurrent or refractory B cell malignancies: a phase 1 trial. Nat Med. 2021 Aug;27(8):1419-1431.
• Kim MY, Jayasinghe R, Devenport JM, et. al. A long-acting interleukin-7, rhIL-7-hyFc, enhances CAR T cell expansion, persistence, and anti-tumor activity. Nat Commun. 2022 Jun 13;13(1):3296.
• Gatla H, Uth N, Levinson Y, et. al. Enabling Allogeneic T Cell-Based Therapies: Scalable Stirred-Tank Bioreactor Mediated Manufacturing. Front Med Technol. 2022 May 30;4:850565.