ELISA加樣、包被物質(zhì)及其濃度
加樣：在ELISA中除包被外，一般需要進(jìn)行4－5次加樣．在定性測定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性，例如規(guī)定為加樣一滴，此時(shí)應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加液姿勢，使每滴液體的體積基本相同．在定量測定中加樣量力求準(zhǔn)確．標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制．加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡．
包被物質(zhì)及其濃度：在ELISA中，將抗原或抗體固定在載體表面，稱為固想的包被或包埋，固想包被的質(zhì)量直接關(guān)系到酶免疫測定法的測定結(jié)果．理想的包被應(yīng)該是：固相表面應(yīng)該吸附盡可能多的特異抗體(或純抗原物質(zhì))；吸附應(yīng)較牢固，能耐受數(shù)次洗滌；非特異性吸附作用要小．具體操作中應(yīng)考慮下述因素：包被物質(zhì)及包被濃度，包被緩沖液的pH及離子強(qiáng)度，包被溫度，時(shí)間及洗滌等．
抗原或抗體吸附于固相，吸附能力有差異．固相包被的機(jī)制有三種：第一種是物理性吸附，即抗原或抗體通過物理力被動地吸附于疏水性固相載體的表面，物理性吸附的過程較簡單，不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不需特殊條件，適用于多種類型和型式的載體，如聚苯乙烯試管及酶標(biāo)板凹孔，纖維素膜等，目前使用最廣泛； 第二種是共價(jià)交聯(lián)，先讓物理惰性物質(zhì)(固相)接上化學(xué)性質(zhì)活潑的基團(tuán)，通過該基團(tuán)再把抗原或抗體與固相載體交聯(lián)，引入的活性基團(tuán)常 為戊二醛．濾紙亦可作為固相，先用溴化*激活紙質(zhì)纖維素，再與抗體交聯(lián)，用化學(xué)交聯(lián)法制得的固相，其吸收容量大，批號之間的差異小，而且價(jià)格低廉，用共價(jià)法交聯(lián)可能是固相包被標(biāo)準(zhǔn)化的最佳途徑； 第三種是交聯(lián)于蛋白質(zhì)，應(yīng)用極少．
固相抗體與固相表面的吸附是通過物理作用．糖蛋白類物質(zhì)如癌胚抗原，血型物質(zhì)，脂蛋白，細(xì)菌脂多糖，糖脂及變性DNA，均可吸附于聚苯乙烯塑料表面，而天然DNA，中性多糖用于包被塑料固相表面的效果不佳或背景著色深．有人認(rèn)為聚苯乙烯吸附抗原好，聚乙烯吸附抗體效果好．有一些預(yù)處理固相板的方法可以改善吸附，如廠家用射線照射，使用者用乙酸，鹽酸，戊二醛或多聚賴氨酸處理板．用戊二醛和鹽酸預(yù)處理板不僅促進(jìn)吸附，還能降低非特異性反應(yīng)，用多聚賴氨酸可增強(qiáng)某些多糖抗原的吸附．
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