ELISA加樣、包被物質及其濃度
加樣：在ELISA中除包被外，一般需要進行4－5次加樣．在定性測定中有時不強調加樣量的準確性，例如規定為加樣一滴，此時應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加液姿勢，使每滴液體的體積基本相同．在定量測定中加樣量力求準確．標本和結合物的稀釋液應按規定配制．加樣時應將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現氣泡．
包被物質及其濃度：在ELISA中，將抗原或抗體固定在載體表面，稱為固想的包被或包埋，固想包被的質量直接關系到酶免疫測定法的測定結果．理想的包被應該是：固相表面應該吸附盡可能多的特異抗體(或純抗原物質)；吸附應較牢固，能耐受數次洗滌；非特異性吸附作用要小．具體操作中應考慮下述因素：包被物質及包被濃度，包被緩沖液的pH及離子強度，包被溫度，時間及洗滌等．
抗原或抗體吸附于固相，吸附能力有差異．固相包被的機制有三種：第一種是物理性吸附，即抗原或抗體通過物理力被動地吸附于疏水性固相載體的表面，物理性吸附的過程較簡單，不發生化學反應，不需特殊條件，適用于多種類型和型式的載體，如聚苯乙烯試管及酶標板凹孔，纖維素膜等，目前使用最廣泛； 第二種是共價交聯，先讓物理惰性物質(固相)接上化學性質活潑的基團，通過該基團再把抗原或抗體與固相載體交聯，引入的活性基團常 為戊二醛．濾紙亦可作為固相，先用溴化*激活紙質纖維素，再與抗體交聯，用化學交聯法制得的固相，其吸收容量大，批號之間的差異小，而且價格低廉，用共價法交聯可能是固相包被標準化的最佳途徑； 第三種是交聯于蛋白質，應用極少．
固相抗體與固相表面的吸附是通過物理作用．糖蛋白類物質如癌胚抗原，血型物質，脂蛋白，細菌脂多糖，糖脂及變性DNA，均可吸附于聚苯乙烯塑料表面，而天然DNA，中性多糖用于包被塑料固相表面的效果不佳或背景著色深．有人認為聚苯乙烯吸附抗原好，聚乙烯吸附抗體效果好．有一些預處理固相板的方法可以改善吸附，如廠家用射線照射，使用者用乙酸，鹽酸，戊二醛或多聚賴氨酸處理板．用戊二醛和鹽酸預處理板不僅促進吸附，還能降低非特異性反應，用多聚賴氨酸可增強某些多糖抗原的吸附．
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