女人与狗锁死了视频大全|霍金死亡过程恐怖视频|无节社团简谱季免费观看|六间房直播大厅|中文字幕欧美另类精品|久久人人玩人妻潮喷内射人人|亚洲国产一区二区三区在线观看

【背景】
? ? ??? CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導的殺傷細胞”。 CIK是單個核細

?胞在CD3單抗和多種細胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培養獲得的一群以CD3⁺CD56⁺細胞為主要效應細

?胞的異質細胞群， 其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組

?織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度

?擴增等特點，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。

? ? ? ?DC是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而

?得名。DC是由2011年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學家Ralph M. Steinman于1973年發現的，是目前發現

?的功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實，DC是唯一能夠顯著刺激初始T細胞

?(Na?ve ?T cells)增殖的APC，而其它APC(如單核巨噬細胞，B細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T細胞。

?DC是機體適應性T細胞免疫應答的始動者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。

? ? ? ?DC-CIK即DC和CIK細胞在體外共培養，然后回輸給患者。嚴格的說，最終的效應細胞是經DC體外活化

?的CIK細胞。多項研究表明，DC與CIK具有協同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達及抗原遞呈

?能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內外細胞毒活性也得以增強，因此DC-CIK較單獨的CIK治療更為

?有效。若將腫瘤抗原負載的DC與CIK共培養，可刺激產生腫瘤抗原特異性的T細胞，這樣的DC-CIK治療則

?兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強，常被用于臨

?床和科研。

【培養原理】
1．DC培養用細胞因子：

? ? ? ?GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)：

? ? ? GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細胞和巨噬細胞的集落形成，并具有促進早期紅巨

? 核細胞、嗜酸性祖細胞增殖和發育的 功能。GM-CSF是最早被鑒定出來對于DC有作用的細胞因子之一。

? ? ? GM-CSF在DC培養中的功能是促進單核細胞向大巨噬樣細胞分化，細胞表面MHC II類分子的表達得以提

? 高，從而增強細胞的抗原遞呈功能。 此外，GM-CSF還可促進DC的存活。

? ? ? ?IL-4 (白細胞介素-4)

? ? ? IL-4在由單核細胞誘導成DC的過程中發揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從而引導單核細胞向DC

? ?方向分化。若培養體系中不加IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。同時，IL-4還有降低細胞表面表達CD14

? ?分子的能力。CD14表達水平的降低是單核細胞分化為DC的重要標志。

? ? ? ?GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟DC(immature DC)，此時的DC具有較強的抗原

? ?攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細胞表面中度表達MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86

? ?等)， 但不表達CD14。

? ? ? ? TNF-a(腫瘤壞死因子-a)

? ? ? ?TNF-a可下調未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達，使細胞內MHC II類分子區室(class II
? ?compartment)消失，但能夠上調細胞表面 MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表達，使

? ?未成熟DC分化為成熟DC(mature DC)，此時DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增

? ?強，可極強的激活T細胞。

2．CIK培養用細胞因子和抗體：

? ? ? ? CD3激發型單抗：

? ? ? ?T細胞活化的第一信號來自于T細胞表面的受體，即T細胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC

? 提呈的抗原的特異性結合，也就是T細胞對抗原的特異性識別。TCR是由2條不同肽鏈構成的異二聚體，在

? T細胞表面，其與CD3分子通過非共價鍵結合，形成TCR/CD3復合體。TCR識別特異性抗原后會引起CD3和

? T細胞表面的輔助受體CD4或CD8分子的胞漿尾部聚集，進而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck,?Fyn和

? ZAP-70等)，促使CD3分子胞漿區的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation

? motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)進一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激

? 酶活化的級聯反應(磷脂酰肌醇途徑或MAP激酶途徑等)，最終通過激活轉錄因子，使其進入細胞核內，結

? 合于調控T細胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表達和轉錄，T細胞因而由靜止狀態轉

? 為增殖和活化狀態。

? ? ? ?由上可見，CD3分子在T細胞活化信號的轉導中起著極其關鍵的作用。CD3激發型單抗與T細胞表面CD3

? 分子特異性結合后，可引起CD3分子胞漿區ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進而導致T細胞增殖和活化的下游

? 信號的激活，從而使T細胞增殖和活化。也就是說，CD3激發型單抗能 夠模擬抗原與TCR/CD3復合物的識別

? 和激活過程，從而引起T細胞的增殖與活化，因此是CIK細胞培養中不可或缺的刺激因素。

? ? ? ? 此外，CD3激發型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3的CD3激發型單抗可

? 以刺激所有人的T細胞的增殖，而其它克隆號的CD3激發型單抗僅能刺激一部分人的T細胞。因此，在進行

? CIK培養時，最好選用OKT-3克隆，以保證每個患者的T細胞均能被激活。

? ? ? ? ?IL-2 (白細胞介素-2)

? ? ? ? IL-2最初發現時被稱為T細胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T細胞增殖最重要的細胞因

? ?子。IL-2既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與T細胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結合

? ?而促使T細胞活化，并進入細胞分裂狀態。此外，IL-2還可刺激NK細胞的生長并增強其殺傷能力。因此CIK

? ?細胞培養中須添加IL-2，以促進T細胞的增殖與活化。

? ? ? ? ?IFN-g(干擾素-g)

? ? ? ? IFN-g;具有上調外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促增殖反應的敏感度和

? ?強度。在誘導CIK細胞形成的過程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究發現，IFN-g加入的順序與CIK的

? ?細胞毒活性密切相關。先加入IFN-g，培養24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細胞毒活性。

? ? ? ? ? IL-1-a (白細胞介素-1a) 　

? ? ? ? ?IL-1a也可以介導外周血淋巴細胞表面上調表達IL-2R。當IL-1a與IFN-g和激發型CD3單抗合用時，可以

? ? 明顯提高CIK 的細胞毒作用。

【細胞制備】
1． 外周血單個核細胞的采集
? ? ? ?1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞80 - 100ml；
? ? ? ?1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)。
? ? ? ?1.3 無血清培養液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC，細胞數量需達到1-3 x 10⁸。

2． (可選步驟) 腫瘤抗原的制備
? ? ? ? ? ? 用于負載DC的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關抗原

? ? ? ?(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細胞抗原。

? ? ? ? ? ? ?用TSA或TAA負載的DC具有很好 可克服這些缺陷，因為此時無需知道那些抗原是腫瘤細胞的

? ? ? ?TSA或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC可誘導產生針對不同抗原決定簇的細胞毒T 淋

? ? ? ?巴細胞(CTL)克隆， 從而實現對腫瘤細胞的有效殺傷。

? ? ? ? ? ? ?腫瘤細胞全抗原負載DC的方法很多，包括用腫瘤細胞裂解液負載DC、用凋亡腫瘤細胞負載DC、

? ? ? ?用壞死或死亡的腫瘤細胞負載DC，用腫瘤 活細胞負載DC，和將腫瘤細胞與DC融合等。目前臨床上常

? ? ? ?用的是用腫瘤細胞裂解液負載DC，因該方法簡單、快速、有效。

? ? ? ? ? ? ? 反復凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：
? ? ? ? ?2.1 ?手術切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；
? ? ? ? ?2.2 ?無菌生理鹽水洗3次；
? ? ? ? ?2.3 ?用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640培養基，充分研磨；
? ? ? ? ?2.4 ?200目無菌網過濾后收集單細胞懸液；
? ? ? ? ?2.5 ?用RPMI 1640培養基重懸細胞至1-2 x 10⁷/ml，裝入5ml無菌凍存管中；
? ? ? ? ?2.6 ?將凍存管浸入液氮中速凍，10 min后取出，再迅速放入37^oC水浴中解凍10 min。反復3-5次；
? ? ? ? ? ? ? ? 注：也可以-80^oC/37^oC反復凍融3-5次。
? ? ? ? ?2.7 ?將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；
? ? ? ? ?2.8 ?收取上清，0.22mm濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；
? ? ? ? ?2.9 ?-80^oC保存備用。

3． CIK細胞的培養及鑒定
? ? ? ? 3.1 ?步驟1中獲得的PBMC 用無血清培養液調整細胞濃度至2 x 10⁶/ml，置于培養瓶內；
? ? ? ? 3.2 ?37℃，5%CO₂培養箱中孵育2h，以使單核細胞貼壁;
? ? ? ? 3.3 ?收集懸浮細胞，用無血清培養液調整細胞濃度至1-2 x 10⁶/ml；
? ? ? ? 3.4 ?加入1,000 U/ml 的重組人IFN-g培養；
? ? ? ? 3.5 ?24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細胞的生長和增殖；
? ? ? ? ? ? ?注：此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1a。
? ? ? ? 3.6 ?每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
? ? ? ? 3.7 ?在培養的第7d，收獲CIK細胞，此時數量應達到1x 10⁹個以上。
? ? ? ? 3.8 ?CIK細胞質控：
? ? ? ? ? ? ? 3.8.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應在80%以上；
? ? ? ? ? ? ? 3.8.2 用流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表達，觀察CD3⁺CD56⁺細胞的比例是否

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?明顯提高。

4． DC 細胞的培養及鑒定
? ? ? ?4.1 ?步驟3.2中剩下的貼壁細胞(主要是CD14⁺的單核細胞)，加入含重組人GM-CSF 500-1,000U/ml和重組

? ? ? ? ? ? ?人IL-4 500U/ml的無血清培養液，37℃，5%CO₂培養箱中培養，誘導單核細胞向DC細胞分化；
? ? ? ?4.2 ?每3d 半量換液一次，并補足細胞因子；
? ? ? ?4.3 ?(可選步驟) 在培養的第5d， 加入步驟2中獲得的腫瘤抗原50 mg/ml，對DC進行抗原負載；
? ? ? ? ? ? ? 注：若不對DC進行抗原負載，該步省略。
? ? ? ?4.4 ?在培養的第6d，加入重組人TNF-α(500U/ml)，誘導DC 細胞成熟；
? ? ? ?4.5 ?在培養的第7d或第8d，收獲DC 細胞，其數量應達到1×10⁶個以上；
? ? ? ?4.6 ?DC的質檢：
? ? ? ? ? ? ?4.6.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應在80%以上；
? ? ? ? ? ? ?4.6.2 流式細胞儀檢測DC 細胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表達，以確定DC是否成熟。

5. DC-CIK細胞的制備和質檢
? ? ? ?5.1 收集步驟4和步驟3中所獲得的DC 細胞和CIK 細胞，按1∶10 (數目比)的比例共培養，無血清培養液

? ? ? ? ? ? ?中添加重組人IL-2 (300 U/ml)；
? ? ? ?5.2 ?每3天半量換液一次，并補加重組人IL-2 (300U/ml)。
? ? ? ?5.3 ?在第7d 收集細胞，細胞數量應達到1×10¹⁰個以上；
? ? ? ?5.4 ?DC-CIK細胞的質檢：
? ? ? ? ? ? ?5.4.1 臺盼藍染色檢測：活細胞應在80%以上；
? ? ? ? ? ? ?5.4.2 流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3⁺CD56⁺細胞的比例應在20%
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?以上。?
? ? ? ? ? ? ?5.4.3 ?細胞殺傷實驗：以DC-CIK細胞為效應細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?靶細胞，將效應細胞與靶細胞按10 :1(數目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細胞1x

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 10⁴個，終體積為200 ml，設3個復孔。培養4h，然后取培養上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?劑盒檢測效應細胞對靶細胞的殺傷率。

? ? ? ? ? ? ?5.4.4 收獲細胞前，取少量培養物進行細菌、真菌培養，并檢測支原體、衣原體，及內毒素(標準：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?病原學檢測陰性，內毒素<5 Eu)。

【步驟簡圖】



【推薦試劑】

【參考文獻】
? ? ?[1] Steinman RM, Cohn ZA. "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I.
? ? ? ? ? Morphology, quantitation, tissue distribution".J. Exp. Med. 1973; 137 (5): 1142–62.
? ? ?[2] 張志偉，宋鑫。DC-CIK 細胞臨床制備規范化研究。中國腫瘤，2011；20(2)：85-88.
? ? ?[3] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II
? ? ? ? ? clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133.