?使用說明：1.?需要用戶自己準備的耗材和試劑
a.?PBS?，或PBS (pH7.2-7.6)。
b.?固定液(免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛P0099)。
c.?洗滌液(免疫染色封閉液，QuickBlock?免疫染色封閉液或，或PBS)。
d.?通透液免疫染色強力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)。
e.?內源性過氧化物酶封閉液(內源性過氧化物酶封閉液，甲醇或PBS配制的0.3%過氧化氫溶液)。
f.?去離子水或超純水。
g.?根據實驗要求：18×18mm蓋玻片，6孔板或其它多孔板。
2.?檢測體系的準備
a.?如下以6孔板或常規切片檢測體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測體系可以相應按比例縮小。
b.?如果檢測的是懸浮細胞，請按常規的懸浮細胞的操作方式進行。例如和貼壁細胞相比，相關步驟需要增加離心步驟等。
3.?培養細胞的EdU標記及固定、洗滌和通透
a.?在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養適當數量的細胞。細胞培養過夜并且恢復到正常狀態后，進行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b.?配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細胞培養液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c.?將37℃預熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變為1X。例如設計終濃度為10μM，原先6孔板中的培養基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養基體積過大，可以先吸除適量的培養液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養液可能會對細胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養液。
d.?繼續孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續孵育細胞周期10%左右的時間。對于常見的哺乳動物細胞如HeLa、3T3、HEK293等，細胞周期大約在18-25小時，孵育時間宜在2小時左右。人胚胎細胞的細胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘；酵母細胞的細胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經細胞其細胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當降低EdU的濃度。
e.?EdU標記細胞完成后，去除培養液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
f.?去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞3次，每次3-5分鐘。
g.?去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h.?去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘。
i.?再用內源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活內源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
j.?轉步驟5。
4.?動物體內EdU的標記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進食等適當方式進行動物的體內標記。如下以小鼠為例，其它動物體內EdU的標記請參考相關文獻。
a.?對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關，可以參考相關文獻，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進行測試。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨購買。
b.?4小時后或根據特定實驗確定的適當時間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標記的時間也可以參考相關文獻自行調整。
c.?對于冰凍切片：
(a) 加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。
(b) 去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c) 去除洗滌液，用適量通透液(可以使用免疫染色強力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d) 去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e) 抗原修復(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進行抗原修復，可以使用適當的抗原修復液，例如冰凍切片快速抗原修復液(5X)，或者自行配制的適當的抗原修復液進行抗原修復處理。
(f) 用內源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
(g) 轉步驟5。
d.?對于石蠟切片：
(a) 脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b) 抗原修復(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當的抗原修復液，例如檸檬酸鈉抗原修復液(50X)、改進型檸檬酸鈉抗原修復液(50X)、?EDTA抗原修復液(50X)、檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液(40X)、通用型強力抗原修復液(10X)、漂片抗原修復液(10X)，或者自行配制適當的抗原修復液進行抗原修復處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進行抗原修復，必須反復洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴重干擾后續標記反應。
(c) 用內源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
(d) 轉步驟5。
5.?EdU檢測
注意：本步驟六孔板中每孔的反應體系為500μl的反應混合物。對于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應混合物。對于較小的孔，單位培養面積的液體用量已經適當增加，以有效避免液體蒸發可能帶來的負面影響。對于切片，可以根據切片大小，每個切片使用100-200μl的反應混合物。如下以六孔板中的細胞樣品為例說明具體的操作方法，對于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調整即可，其余方法相同。
a.?配制Click Additive Solution：對于，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當分裝，并-20℃保存。
b.?參考下表配制Click反應液。注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制Click反應液，否則點擊反應可能無法有效進行；同時，Click反應液須在配制后15分鐘內使用。

c.?去除上一步驟中的洗滌液。
d.?每孔加入0.5ml Click反應液，輕輕搖晃培養板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品。
e.?室溫避光孵育30分鐘。孵育時需注意在多孔板的空隙中加水，或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒)來保持濕潤，以盡量減少反應液的蒸發。
f.?吸除Click反應液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
6.?Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制：
a.?Streptavidin-HRP工作液的配制：
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液，須充分混勻。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。

b.?DAB顯色液的配制：
按照每個樣品使用0.2-0.4ml顯色液的比例配制適量DAB顯色液。等體積混合適量DAB顯色液A和DAB顯色液B，充分混勻后即為DAB顯色液。注意：配制好的DAB顯色液必須一次使用完畢，不宜凍存。
7.?樣品的顯色：
a.?在樣品上加200μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30分鐘。
注意：Streptavidin-HRP工作液的用量以完全覆蓋樣品為準。孵育時需注意在多孔板的空隙中加水，或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒)來保持濕潤，以盡量減少Streptavidin-HRP工作液的蒸發。
b.?用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
c.?滴加0.2-0.4ml DAB顯色液，室溫孵育5-30分鐘。
注：如果顯色很強可以短于5分鐘即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當延長顯色時間，甚至顯色過夜。
d.?用洗滌液洗滌3次，即可終止顯色反應。如有必要可以使用適當的染色液進行復染，如伊紅染色液、甲基綠染色液、蘇木素染色液、DAPI染色液等。普通光學顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。