FLIPR和電壓敏感探針

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簡介

FLIPR^TETRA和電壓敏感探針：比率檢測氯化鋇誘導的大鼠嗜堿性白血病細胞上內向整流鉀通道（Kir）的變化

?離子通道和轉運體是位于細胞膜上調控離子穿過生物膜的蛋白質。對這些蛋白質的研究已經引起了心律失常、高血壓和神經紊亂等疾病的藥物治療開發。同時，這些蛋白質也是藥物不良反應潛在的作用位點。高通量篩選方法在使用最小量化合物產生有用數據方面具有高效率和成本效益好等特點。FLIPR^TETRA? 系統配置了390–420nm波長激發光LED以及440–480nm和565–625nm波長的濾光片，使用電壓敏感探針(Voltage Sensor Probe, VSP)染料用于基于FRET原理的高通量篩選（HTS）實驗，提供了一種新型的細胞基礎的膜電位變化檢測方法。在本實驗中，包含了一種內向整流鉀通道（Kir）的大鼠嗜堿性白血病細胞——RBL-2H3被誘導引起了細胞膜電位變化。氯化鉀被用來引起細胞膜去極化，而氯化鋇被用于阻斷這個去極化反應。比率化分析對FRET數據進行了背景校正和直接對比。本篇應用文章展示了FLIPR^TETRA系統結合VSP染料所帶來的靈敏和高效的離子通道與轉運體引起的細胞膜電位變化的檢測實驗。

基于FRET的電壓敏感探針作用機理

電壓敏感探針是一種基于熒光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer ，FRET)原理的用于高通量離子通道藥物研發的實驗技術。FRET供體--香豆素-磷脂(coumarin-phospholipid，CC2-DMPE)只結合在細胞膜外側。FRET受體是可移動的、帶負電荷的疏水性類菁染料化合物染料(oxonol)[DiSBAC2(3)或DiSBAC4(3)]，根據膜電位變化結合在細胞膜的一側。靜息細胞膜電位是負的。因而，兩個探針都結合在細胞膜的外側，實現有效的FRET效應。390–420nm波長LED 激發CC2-DMPE供體探針，從oxonol受體探針處產生580nm波長強的紅色熒光信號。當細胞膜電位變正后，例如KCl引起的細胞去極化，oxonol受體探針快速的改變位置至膜的另一側。因此，每個oxonol受體探針對細胞電位變化“感受“并反應。這種轉移位置打破了FRET效應，CC2-DMPE供體探針激發后在460nm波長產生了強的藍色熒光信號。

材料

RBL-2H3：含有內向整流鉀通道(Kir)的大鼠嗜堿性白血病細胞 (ATCC Cat. #CRL-2256)

培養基：Eagle’s Minimum Essential Media (ATCC Cat. #30-2003), 10% FBS (Hyclone Catalog Cat. #SH-30071)

不含鈣、鎂的PBS (Invitrogen Cat. #14190-144) Trypsin/EDTA (0.05% Trypsin/1mM EDTA) (Invitrogen Cat. #25300-054)

VSP溶液-1：160 mM NaCl (Sigma Cat. #S-5886), 4.5 mM KCl, (Sigma Cat. #P5405), 2 mM CaCl2 (Sigma Cat. #C-7902), 1 mM MgCl2 (Sigma Cat. #M-4880), 10 mM glucose (Sigma Cat. #G-7021), 10 mM HEPES (Invitrogen Cat. #15630-080), pH 7.4

高鉀溶液：164 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4

無菌水 (Irvine Scientific Cat. #9309)

DMSO (Dimethyl Sulfoxide, Aldrich Cat. #47,230-1)

氯化鋇 (Sigma Cat. #B-0750)

Pluronic F127 (Invitrogen Cat. #P3000)

電壓敏感探針試劑盒：DisBac2(3)和CC2-DMPE (Invitrogen Cat. #K1016), VABSC-1 背景抑制染料 (Invitrogen Cat. #K1019)

FLIPR^TETRA 高通量熒光檢測分析系統(Molecular Devices)

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方法

細胞準備

用胰酶消化預先培養的RBL-2H3細胞，實驗前18-24小時清洗并種植在BD BioCoat?多聚賴氨酸包被的384孔板 (Cat. #356663, BD Biosciences)中，每孔12,500個細胞。細胞在37°C和5% CO2條件下過夜培養。實驗開始當天母液、染料和緩沖液可室溫放置。VSP加載緩沖液和氯化鋇濃度梯度化合物在VSP-1緩沖液中配制。

準備VSP加載緩沖液

CC2-DMPE緩沖液：

Step 1 準備5mM DMSO母液并分裝保存至-20°C。

Step 2 實驗開始當天，準備一份工作溶液。CC2-DMPE母液和同體積的10% Pluronic Acid混合并隨后用VSP-1溶液稀釋至5μM。

Step 3 緩沖液在使用前充分混合并避光。

DiSBAC2(3)緩沖液：

Step 1 準備12mM DiSBAC2(3)的DMSO母液并保存至 -20°C.

Step 2 準備200mM VABSC-1的水質母液并在室溫下避光保存。更多說明參考Invitrogen VSP 產品手冊

Step 3 實驗開始當天，用VSP-1溶液準備4μM DiSBAC2(3)的工作溶液，其中含有0.2μM VABSC-1 淬滅劑。在FLIPRTETRA系統中進行VSP染料實驗除安裝相應的LED和濾光片之外沒有其它特別要求。

細胞中加載染料

Step 1 去除384孔板中所有孔的培養基，并加入50μL VSP-1溶液代替。

Step 2 立即去除VSP-1溶液并加入25μL的CC2-DMPE加載緩沖液。

Step 3 室溫下細胞板覆蓋避光孵育30分鐘。

Step 4 30分鐘后去除CC2-DMPE加載緩沖液并加入50μL的VSP-1溶液。

Step 5 立即去除VSP-1并加入25μL的4μM DiSBAC2(3)和0.21 μM VABSC-1加載緩沖液。

Step 6 加入10X 濃度的BaCl2 化合物(離子通道抑制劑)至相應的孔中

Step 7 室溫下細胞板避光孵育30分鐘。更多詳細信息參考Invitrogen VSP使用指南。

FLIPR^TETRA 系統配置和校正

FLIPRTETRA 系統的操作軟件ScreenWorks.具有非常友好的用戶界面，便于進行實驗方案的編輯和參數設置。更多信息可參考FLIPRTETRA 用戶指南。系統自帶一個黃色檢測板可用于校正390–420nm激發光源LED和565–625nm發射光濾片。 含有7-二乙胺香豆素-3-羧酸的檢測板被用于校正390–420nm激發光源LED和440–480nm發射光濾片，具體步驟見下。

390–420 nm激發光源LED和440–480 nm 濾光片 校正板制備

Step 1 配制0.02M的7-二乙胺香豆素-3-羧酸DMSO母液（Molecular Probes Cat. #D-1421）。

置于離心管中渦旋混合。

Step 2 分裝成小份并保存于-20°C。

Step 3 在校正的1小時內，溶解一份第二步母液并在同樣的用于染料加載的緩沖液中稀釋成20–30 mL 10-5 M溶液。調節pH值至7.4，渦旋混合。

Step 4 每孔加入分裝的香豆素溶液25μL（384孔板）或100μL（96孔板）。

在FLIPRTETRA系統中運行VSP實驗

實驗溶液體積、加樣高度和速度等參數取決具體具體實驗和細胞類型的要求來進行優化，以避免吹動孔底的細胞。

表1是推薦的RBL-2H3細胞實驗機器參數設置，以供參考。

在FLIPR^TETRA系統中，加入25μL高K+去極化溶液前440–480nm和565–625nm的信號依次被記錄10秒并在加樣后40秒再次被記錄10秒。實驗中這兩個時間點平均的信號記錄構成了比率分析的基礎。

比率數據計算

比率數據分析提供了背景校正和FRET的440–480nm和565–625nm數據的直接對比。同一細胞的數據結果可以在極化和非極化狀態下進行對比。圖2所示是來自FLIPR^TETRA系統的一組數據示例。

在相同的數據窗口中，檢測了加樣前和加樣后40-60