過氧化氫酶檢測試劑盒(Catalase Assay Kit)是一種簡單易行的通過顯色反應來檢測細胞、組織或其它樣品中過氧化氫酶

(Catalase)活性的試劑盒。在過氧化氫相對比較充足的情況下，過氧化氫酶可以催化過氧化氫產生水和氧氣。殘余的過氧化氫在過氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物，產生紅色的產物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-benzoquinonemonoimine)，最大吸收波長為520nm。用過氧化氫標準品，制作標準曲線，這樣就可以計算出樣品中的過氧化氫酶在單位時間單位體積內催化了多少量的過氧化氫轉變為水和氧氣，從而可以計算出樣品中過氧化氫酶的酶活力。
過氧化氫酶分布非常廣泛。在肝臟、腎臟和紅細胞中，過氧化氫酶的水平非常高，是清除能導致氧化損傷的過氧化氫的主要場所。
過氧化氫酶的活性也可以用紫外分光光度計測定A240，但蛋白質或其它組份在A240附近都有比較強的吸收，會對測定產生嚴重干擾。因此，用紫外法測定過氧化氫酶的活性，比較適合純化的過氧化氫酶。本試劑盒通過檢測A520來測定過氧化物酶催化下由過氧化氫氧化生色底物產生的紅色產物，受干擾的因素小，檢測靈敏度高，可以檢測出低達1U/ml的過氧化氫酶。
本試劑盒可以檢測全血、紅細胞裂解產物、血清、組織勻漿產物、細胞裂解產物等生物樣品中的過氧化氫酶的活性。一個試劑盒共可以進行100次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。 過氧化氫酶檢測緩沖液和過氧化氫酶反應終止液也可以4℃保存。
注意事項：
待測的過氧化氫酶樣品，無論是純的過氧化氫酶還是細胞或組織裂解產物，在4℃通?？梢员４?周，-70℃可以長期保存，但-20℃保存后過氧化氫酶的活力會顯著下降。
在檢測過程中加入過氧化氫酶反應終止液后15分鐘內需開始顯色反應。
過氧化氫不太穩定，精確的過氧化氫濃度需參考本說明書中的方法進行測定。
如需對樣品中的過氧化氫酶活力進行精確定量，需自備蛋白濃度測定試劑盒。例如可以選購生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測定樣品的蛋白濃度。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 試劑盒的準備工作：
a. 配制250mM過氧化氫溶液。本試劑盒提供的過氧化氫濃度約為1M。由于過氧化氫不是非常穩定，使用前需自行測定過氧化氫的實際濃度。把濃度約為1M的過氧化氫用本試劑盒提供的過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋100倍，使過氧化氫的濃度約為10mM。測定A240。A240的測定可采用如下的任一方法：
(a)普通紫外分光光度計法：使用含比色皿架的紫外分光光度計、NanoDrop 2000C、NanoDrop One?、QuickDrop等儀器，配套石英比色皿。確定比色皿光程(path length)，一般為1cm。用比色皿檢測的過氧化氫濃度最接近實際濃度。
(b)微量紫外分光光度計法：如NanoDrop 2000、NanoDrop One、QuickDrop、含超微量檢測板μDrop Plate的Varioskan等儀器。確定光程：對于NanoDrop 2000、NanoDrop One等，需要取消“自動化光程”，此時光程一般為0.1cm；Varioskan的超微量檢測板μDrop Plate的光程一般為0.05cm。具體的微量紫外分光光度計的光程請參考儀器參數。
(c)96孔紫外酶標儀法(須能檢測240nm波長)：根據96孔板的參數確定光程，一般200微升樣品的光程為0.552cm (樣品體積除以96孔單孔孔內橫截面面積)。一般建議使用專用的96孔紫外檢測板(如96孔UV板)，如果沒有紫外檢測板，也可使用一般的96孔板，但由于為非紫外檢測專用板，會有非常高的紫外吸收信號，所以需要設置含等量雙蒸水的孔作為空白對照(一般200μl水在該類96孔板的A240在3.8左右)，計算時須減去該空白對照。在使用非紫外檢測專用板的情況下，由于96孔酶標儀在240nm的檢測上限有限，建議將過氧化氫稀釋至約10mM左右后再進行濃度測定。
注意：以上所有方法都需要設置等量雙蒸水作為空白對照，并在計算時減去該空白對照。
濃度計算公式：c=A/(ε×b)。其中：c為樣品濃度(單位為mol/L或M)；A為吸光值；ε為波長依賴的摩爾消光系數(單位為L×mol-1×cm-1或M-1×cm-1)，過氧化氫的摩爾消光系數為43.6M-1cm-1；b=光程(單位為cm)。
因此：過氧化氫濃度(M)=A240/(43.6×b)；即：過氧化氫濃度(mM)=22.94 × A240/b
從而計算出本試劑盒提供的過氧化氫的實際濃度。
示例：將本試劑盒提供的約為1M的過氧化氫用雙蒸水稀釋100倍后，用96孔酶標儀及一般的96孔板進行檢測，每孔200微升，每組3個平行。雙蒸水對照組的平均A240為3.750，過氧化氫樣品組的平均A240為3.974，差值為0.224，200微升樣品的光程為0.552cm。代入公式，過氧化氫濃度(mM)=22.94×0.224/0.552=9.31，則實際本試劑盒提供的過氧化氫濃度為0.931M。
然后再根據實際的過氧化氫濃度配制250mM過氧化氫溶液。
b. 配制5mM過氧化氫溶液。根據測定得到的實際過氧化氫濃度配制5mM過氧化氫溶液。
c. 配制顯色工作液。在冰浴上溶解顯色底物，適當分裝后再使用，盡量避免反復凍融。其它試劑放置在冰浴上備用。取適當量的過氧化物酶，按照1:1000的比例用顯色底物稀釋，配制成顯色工作液。例如取5μl過氧化物酶，加入5ml顯色底物，混勻即得到5ml顯色工作液。
2. 樣品的準備：
用適當的裂解液裂解細胞或組織(可以使用生產的Western及IP細胞裂解液(P0013)進行裂解。用本試劑盒提供的過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋樣品，裂解好的樣品至少加入等體積的過氧化氫酶檢測緩沖液進行稀釋。具體的稀釋倍數可以參考下表。

說明：表中的數據僅供參考，實際測定值由于檢測體系的不同等可能與參考值之間存在20-50%的誤差。對于相同的樣品，同樣的實驗體系，測得的A520值和表1相比可能會有較大差異。如果實驗體系不同，例如測得蛋白濃度的方法不同，使用的檢測波長不同等，測得的A520值和我們提供的參考數值相比可能會有更大的差異。對于表中沒有列出的樣品，可以參考表中的類似樣品進行檢測，然后再根據檢測結果適當調整蛋白濃度和樣品使用量，或反應時間。通常對于完全未知的樣品，可以對樣品進行1、10、20和50倍稀釋，然后各取10μl，反應1分鐘。樣品稀釋后的濃度，最好可以使反應體系中的過氧化氫在反應1-5分鐘后減少30-50%左右，這時的檢測結果更加精確。
a. 細胞樣品的準備?？梢杂肳estern及IP細胞裂解液(P0013)參考相應的說明裂解細胞樣品。
b. 組織樣品的準備?？梢杂肳estern及IP細胞裂解液(P0013)參考相應的說明裂解組織樣品。
c. 全血樣品的準備。收集全血(whole blood)至一抗凝管內，顛倒混勻。取100微升全血凍融一次，用過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋1000倍后進行后續檢測。
d. 紅細胞裂解液的準備。用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500微升全血4℃ 2500g離心5分鐘。棄上清，沉淀用冰冷的生理鹽水(0.9%氯化鈉)洗滌3次。用約5倍細胞體積的冰冷的去離子水，例如Milli-Q純水，重懸細胞沉淀，冰浴10分鐘。使用前用過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋400倍后進行后續檢測。
3. 標準曲線測定：
a. 取0、12.5、25、50或75微升配制好的5mM過氧化氫溶液至1.5ml或0.5ml塑料離心管中，分別加入過氧化氫酶檢測緩沖液至最后體積為100微升，混勻，此時過氧化氫溶液濃度分別為0、0.625、1.25、2.5、3.75mM。如有需要，可以設置更高濃度的過氧化氫標準溶液。
b. 各取4微升，加入到96孔板中的一個孔內。加入200μl顯色工作液。25℃至少孵育15分鐘后測定A520，但孵育時間不宜超過45分鐘。(注：本步驟可以和樣品測定步驟中的最后一步同時進行。)
4. 樣品測定：

a. 參考上表，取x微升(0-40微升)樣品至1.5ml塑料離心管中，加入過氧化氫酶檢測緩沖液至體積為40微升(即加入40-x微升過氧化氫酶檢測緩沖液)，混勻。再加入10微升250mM過氧化氫溶液，用移液器迅速混勻。參考表1，25℃反應1-5分鐘。
b. 加入450微升過氧化氫酶反應終止液，顛倒混勻或Vortex混勻以終止反應。需在終止反應后15分鐘內完成下面的步驟c和步驟d。
c. 在一潔凈的塑料離心管內加入40微升過氧化氫酶檢測緩沖液，再加入10微升已終止并混勻的上述反應體系，混勻。
d. 從上一步驟的50微升體系中取10微升加入到96孔板中的一個孔內。加入200微升顯色工作液。
e. 25℃至少孵育15分鐘后測定A520，但孵育時間不宜超過45分鐘。
5. 樣品中過氧化氫酶酶活力的計算：
a. 計算出標準曲線。A520＝k[過氧化氫微摩爾數]＋b，由標準曲線計算出k和b的值。標準曲線的檢測效果請參考圖1。
例如本說明書中的標準曲線公式為：y=70.281x +0.06，即k=70.281，b=0.06，則A520＝70.281 × [過氧化氫微摩爾數]+0.06。

圖1. 本過氧化氫酶檢測試劑盒的標準曲線效果圖。配制好的過氧化氫標準溶液(0、0.625、1.25、2.5、3.75、5mM)各取4微升，用本試劑盒進行檢測，對應的微摩爾數分別為0、0.0025、0.005、0.01、0.015、0.02微摩爾。不同的檢測條件下，實際讀數會因檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。

b. 計算出樣品中殘余的過氧化氫微摩爾數。
殘余過氧化氫微摩爾數＝(A520-b)/k
c. 過氧化氫酶酶活力單位的定義：1個酶活力單位(1 unit)在25℃，pH7.0的條件下，在1分鐘內可以催化分解1微摩爾過氧化氫。
d1. 對于細胞或組織樣品的過氧化氫酶活力計算：
[樣品過氧化氫酶酶活力]＝[消耗過氧化氫微摩爾數] × [稀釋倍數]/([反應分鐘數] × [樣品體積] × [蛋白濃度])
[樣品過氧化氫酶酶活力]的單位為units/mg蛋白
[消耗過氧化氫微摩爾數]＝[空白對照殘余過氧化氫微摩爾數]－[樣品殘余過氧化氫微摩爾數]
[稀釋倍數]＝250
[反應分鐘數]即為實際的反應分鐘數
[樣品體積]為表2中的X微升，以毫升來表示即為X/1000毫升。
[蛋白濃度]為取X微升樣品時，樣品中的蛋白濃度，單位為mg/ml。
d2. 對于血漿等液體樣品的過氧化氫酶活力計算：
[樣品過氧化氫酶酶活力]＝[消耗過氧化氫微摩爾數] X[稀釋倍數]/([反應分鐘數]X[樣品體積])
[樣品過氧化氫酶酶活力]的單位為units/ml樣品

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