自1990年螢光素酶生物傳感器技術誕生以來，單螢光素酶檢測系統到雙螢光素酶檢測系統的發展，為科研人員提供了更為嚴謹的實驗手段。

雙螢光素酶報告基因檢測系統在單報告基因的基礎上引入了“內參對照”報告基因，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數目以及轉染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結果更為可靠。

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檢測原理

螢火蟲螢光素酶是一種胞內蛋白，大小為61KDa。在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化底物螢火蟲螢光素氧化，生成氧化螢光素，并發出黃綠色光，其最強發光波長為560nm。

海腎螢光素酶也是一種胞內蛋白，大小為36KDa。只需要氧氣就可以催化腔腸素，氧化生成高能產物coelenteramide，并發出藍光，其最強發光波長為465nm。

對于發光反應，全透明板會有明顯的相鄰孔之間的信號干擾，使測量結果產生誤差。

為此常規實驗操作流程中先在普通的透明細胞培養板中培養細胞，加入檢測試劑待細胞裂解后把樣品轉移到全白檢測板中進行檢測。但此操作復雜且容易使樣本損失。

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如何隔絕信號的同時

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那么在雙熒光素酶檢測中應該如何使用96孔白色培養板呢？

質粒轉染細胞

1、細胞鋪板：將細胞按70%的匯合度接種到96孔板。

2、轉染：16小時后轉染螢光素酶報告基因質粒和RNA，每個樣品設置6個復孔。

1) 配制DNA和轉染試劑: 96孔板轉染質粒時每孔比例Firefly：Renilla：轉染試劑=0.1μg：0.01μg：0.25μL；

2) 配制RNA和轉染試劑稀釋液，RNA的終濃度為100nM，轉染試劑每孔0.25μL；

3) 稀釋好的DNA和RNA及轉染試劑，常溫孵育5min；

4) 將稀釋好的DNA和RNA分別和轉染試劑混勻，常溫孵育20min；

5) 每孔棄去50μL 培養基，將25μL DNA轉染混合液和25μL RNA轉 染混合液分別添加到每孔細胞樣品中；

6) 轉染6小時后，換新鮮完全培養基。

雙報告基因檢測

1、質粒共轉染48小時后，棄去培養基，用100μL1XPBS洗1遍；

2、 傾斜96孔板，吸干剩余的PBS；

3、去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫；

4、每孔加50μl稀釋好的1XPLB，搖床常溫條件下搖15min，進行裂解；

5、加入預先混好的LAR II，2s后測數據；

6、每孔添加100μL預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數據。

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