層析在早期工藝開(kāi)發(fā)活動(dòng)中的應(yīng)用可根據(jù)所使用的層析柱的尺寸、數(shù)量和質(zhì)量分為兩個(gè)基本領(lǐng)域：篩選和工藝開(kāi)發(fā)。
填料和條件篩選?
篩選的目的是針對(duì)每一個(gè)工藝步驟，評(píng)估盡可能多地可行層析填料，包括捕獲、精制I和精制II。此外，評(píng)估待優(yōu)化的可能條件也非常重要，包括保留時(shí)間、pH和摩爾濃度。針對(duì)每一個(gè)步驟都需要進(jìn)行一系列的因子試驗(yàn)。
用于高通量篩選的Repligen RoboColumn? 預(yù)裝層析柱。
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以往，開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)需要在試驗(yàn)開(kāi)始前，花費(fèi)數(shù)周來(lái)裝填這些層析柱，而手動(dòng)裝填的層析柱往往較大，也就意味著需要更多的試驗(yàn)蛋白。顯然，這些局限性會(huì)限制試驗(yàn)性工藝評(píng)估的空間，從而影響構(gòu)建“真正”優(yōu)化的純化工藝。而現(xiàn)在，早期工藝篩選可使用商品化小規(guī)模層析柱平臺(tái)進(jìn)行，即使用多根預(yù)裝特定測(cè)試填料的小規(guī)模預(yù)裝層析柱。預(yù)裝柱通常可使用來(lái)自大部分供應(yīng)商提供的填料，體積范圍1-2mL。而最近的篩選用預(yù)裝柱技術(shù)可將柱體積降低至50-600μL，該產(chǎn)品使用含有不同填料類型的平行排列陣列板，且?guī)缀蹩裳b填所有類型的商品化填料。研究人員可將其篩選矩陣擴(kuò)大至覆蓋所有類型的填料和條件，而不需要使用大量的蛋白質(zhì)。這些微型預(yù)裝柱設(shè)計(jì)可允許手動(dòng)操作或使用自動(dòng)化液體工作站實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化的功能操作。此類現(xiàn)代化的預(yù)裝柱可使研究人員將時(shí)間集中于開(kāi)發(fā)工藝數(shù)據(jù)，而不是裝柱操作。研究人員可更快、更省力地測(cè)試多種不同層析柱/條件組合，以進(jìn)行更高效、全面的mAb工藝開(kāi)發(fā)。
工藝開(kāi)發(fā)
“最佳可行填料”的初步篩選完成后，即可進(jìn)行工藝開(kāi)發(fā)和細(xì)化。針對(duì)每個(gè)工藝步驟，工藝開(kāi)發(fā)的細(xì)化一般聚焦于1-3種候選填料。這些填料在動(dòng)態(tài)流速條件下進(jìn)行測(cè)試，使用基本的保留時(shí)間、流速、pH和離子強(qiáng)度工藝條件。工藝開(kāi)發(fā)層析柱需裝填相同的填料至相同的柱床高度，并在柱效（塔板數(shù)）和不對(duì)稱性等檢測(cè)指標(biāo)方面，保證裝填柱床具有相同的質(zhì)量。為達(dá)到此目的，裝柱必須小心，并關(guān)注其后將用于規(guī)模放大層析柱的參數(shù)細(xì)節(jié)。所以，在篩選過(guò)程中使用的微型或小型層析柱不太適合更為細(xì)節(jié)化的層析評(píng)估，因其要求對(duì)動(dòng)態(tài)液流條件的精確模擬。同樣，工藝開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)的挑戰(zhàn)是裝填用于工藝的多根層析柱：根據(jù)待評(píng)估的填料和條件數(shù)量，在此階段，可能需要30根甚至更多的層析柱。這些層析柱裝填需具可重復(fù)性，并可代表最終生產(chǎn)規(guī)模。裝填這些層析柱將對(duì)工藝開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)造成額外的時(shí)間和資源壓力。
用于工藝開(kāi)發(fā)的Repligen MiniChrom 預(yù)裝層析柱
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預(yù)裝柱可用于此應(yīng)用，但對(duì)其質(zhì)量和一致性需小心選擇。為模擬更大規(guī)模工藝層析柱的性能，預(yù)裝柱直徑需至少為0.5-1.2cm，且柱床高度應(yīng)可盡最大可能地模擬工藝規(guī)模層析柱的所需保留時(shí)間。雖然如預(yù)裝柱裝填良好，不對(duì)稱性可模擬工藝規(guī)模參數(shù)，但裝填這些小規(guī)模層析柱時(shí)，柱壁效應(yīng)會(huì)造成不小的挑戰(zhàn)，這也意味著，對(duì)于任意給定填料，其功能塔板數(shù)會(huì)低于大規(guī)模層析柱。使用相同的填料，以相同的方式，良好裝填的工藝開(kāi)發(fā)層析柱，應(yīng)具有與工藝規(guī)模層析柱預(yù)期的水平下限接近的一致塔板數(shù)。此類層析柱的體積一般為3-10mL，所有需要更多的測(cè)試蛋白質(zhì)，也就是說(shuō)需盡可能減少試驗(yàn)條件的數(shù)量。
最近，多家供應(yīng)商推出了適用于該規(guī)模的預(yù)裝柱，以替代自裝層析柱。預(yù)裝柱的潛在優(yōu)勢(shì)是優(yōu)化工藝開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)的資源利用、覆蓋不同填料和條件的裝柱一致性，以及，如工藝規(guī)模預(yù)裝柱亦由同一家供應(yīng)商裝填，可確保不同規(guī)模的性能可比性。從經(jīng)濟(jì)角度看，雖然自裝柱和預(yù)裝柱技術(shù)的相對(duì)成本需根據(jù)每一種情況進(jìn)行考量，但過(guò)往的經(jīng)驗(yàn)顯示，預(yù)裝柱的成本并沒(méi)有過(guò)高。而且機(jī)會(huì)成本、資源評(píng)估成本、以及對(duì)自裝柱質(zhì)量和重新裝填的現(xiàn)實(shí)評(píng)估，往往會(huì)得出預(yù)裝柱成本效益更好的結(jié)論。
工藝優(yōu)化和故障排除
工藝優(yōu)化和故障排除涉及與工藝優(yōu)化相似的討論，也使用相似尺寸的層析柱（一般為1-2.5cm，其與更大的工藝規(guī)模層析柱更具可比性）。工藝優(yōu)化的目的是用從篩網(wǎng)過(guò)程中所選擇的最終填料和條件，在規(guī)模縮小的動(dòng)態(tài)流速條件下，優(yōu)化工藝。為確定最佳的物理、化學(xué)、流速和體積參數(shù)，這些規(guī)模縮小的層析柱需盡可能地模擬將在最終工藝中使用的層析柱裝柱規(guī)格。
?相似的，在工藝故障排除中，層析柱需能盡可能地反映其所模擬的工藝規(guī)模層析柱。當(dāng)cGMP規(guī)模放大工藝步驟發(fā)生變化或需要進(jìn)一步優(yōu)化時(shí)，往往需進(jìn)行故障排除。在更大規(guī)模的層析柱上進(jìn)行故障排除并非不常見(jiàn)，因?yàn)榇藭r(shí)有更多的蛋白質(zhì)產(chǎn)品可用于試驗(yàn)，且更大規(guī)模的層析柱可更好地預(yù)測(cè)工藝性能，因?yàn)榭上谛?yīng)對(duì)層析柱裝填質(zhì)量的影響。所有，在這種情況下，使用有“中間性”直徑規(guī)格層析柱選擇的預(yù)裝層析柱平臺(tái)就變得特別有用，如2.5、5、8和10cm直徑規(guī)格，其可獲得規(guī)模放大工藝數(shù)據(jù)。
用于工藝驗(yàn)證，包括除病毒驗(yàn)證，的Repligen ValiChrom預(yù)裝層析柱
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除病毒驗(yàn)證
除病毒驗(yàn)證要求使用與工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化相似的層析柱尺寸（一般為1-1.2cm）。此類層析柱應(yīng)足夠大，以支持與更大的工藝規(guī)模層析柱的性能比較，而不需要消耗過(guò)多的測(cè)試蛋白質(zhì)。當(dāng)可用的測(cè)試蛋白量有限時(shí)，也可使用直徑0.5cm的層析柱替代。
預(yù)裝柱技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與前文應(yīng)用相同，即一致性與優(yōu)化的資源利用。但是，隨著所需層析柱數(shù)量的增加，這些優(yōu)勢(shì)也將相應(yīng)地倍增。除病毒驗(yàn)證是化學(xué)、生產(chǎn)和控制（CMC）遞交的關(guān)鍵部分，通常需要5個(gè)或更多的重復(fù)數(shù)據(jù)。對(duì)于一個(gè)使用三步層析進(jìn)行純化的mAb產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，即意味著需要裝填至少15根相似的層析柱（三種填料，5個(gè)重復(fù)）。在某些情況下，重復(fù)的研究可將層析柱數(shù)量增加至30-40。
由于涉及到質(zhì)量控制（QC）、質(zhì)量保證（QA）和法規(guī)方面的事務(wù)，且可能需要進(jìn)行特定的供應(yīng)商質(zhì)量確認(rèn)、驗(yàn)證信息以及審計(jì)，提前計(jì)劃并小心選擇層析柱將變得更加重要。此外，這些驗(yàn)證研究通常會(huì)由合同研究組織（CRO）進(jìn)行，其一般具有較強(qiáng)的病毒操作、管理和測(cè)試專業(yè)性，但不一定具備出色的層析或裝柱能力。而如果項(xiàng)目發(fā)起方的工藝開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)自己裝填玻璃柱，就對(duì)其增加了裝柱以及將大量的測(cè)試層析柱運(yùn)輸?shù)紺RO（希望運(yùn)輸過(guò)程不會(huì)改變測(cè)試層析柱的柱效）的問(wèn)題。在此類應(yīng)用中，預(yù)裝層析柱的優(yōu)勢(shì)還可在前文所述優(yōu)勢(shì)上進(jìn)一步擴(kuò)展，因?yàn)轭A(yù)裝柱供應(yīng)商會(huì)有經(jīng)確認(rèn)的運(yùn)輸程序，且可能有超千根預(yù)裝柱的運(yùn)輸經(jīng)驗(yàn)，并文件記錄運(yùn)輸后的性能，包括對(duì)運(yùn)輸前層析柱測(cè)試參數(shù)的維持。
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