Easy-Load? Multiplex PCR Master Mix (2X)，即Easy-Load?多重PCR預混液(2X)，是一種使用特別便捷的專門用于多重PCR擴增的2倍濃度的PCR預混液，并且PCR結束后可以直接上樣電泳無需添加上樣緩沖液。本產品含有Multi? DNA polymerase，可以高效、高特異性和高靈敏度的適用于對多個(可以超過20個)目標DN**段同時進行非常均衡的PCR擴增。并且本產品不僅可以用于普通的多重PCR，更可以用于全血、血清或植物樣品的直接PCR，便于直接用于血液樣品中細菌和病毒感染、基因突變等的多重PCR檢測，或者用于植物樣品的基因突變、微生物感染等的多重PCR檢測。

多重PCR是一種通過單個PCR反應同時對至少兩個或多個DN**段進行擴增的PCR技術。目前該技術已被廣泛應用于科學研究、疾病診斷和法庭或診斷性的基因分型(Genotyping)等多個領域。該技術還可以被用于以cDNA為模板的基因定量或半定量的表達分析，其特別適合于各種動植物、真菌、細菌或病毒等微量樣品進行多基因檢測，具備高特異性和高靈敏度的突出優點。

本產品多重擴增性能優越。本產品實測可以輕松實現15個目標DN**段的同時并且非常均衡的高效、高特異性和高靈敏度擴增(參考圖1)。對于低至1pg的模板量，也可以通過僅30個PCR循環而被很好地擴增(參考圖1)。普通的PCR試劑盒會由于PCR擴增時引物和模板的偏好性，對于不同的引物和不同的模板會產生不同的擴增效率，導致部分片段容易被擴增，而部分片段較難被擴增。本試劑盒使用了通過精心篩選和突變優化的非常適合用于多重PCR的DNA聚合酶Multi? DNA polymerase和反復優化的配套緩沖液，確保可以實現多個目標DN**段的高效、高特異性和高靈敏度的均衡擴增。

本產品可同時對低至100pg的樣品模板的15個基因片段進行有效的多重PCR檢測(圖1)。

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圖1. Easy-Load? Multiplex PCR Master Mix (2X)進行多重PCR擴增的實測電泳效果圖。以圖中指定量的Lambda噬菌體基因組DNA為模板，按照本產品的使用說明每個樣品采用20μl PCR擴增體系，使用15對引物進行多重PCR擴增，每條引物的終濃度為0.2μM，PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec、60℃退火30sec、68℃延伸3min；最后68℃延伸10min；共30個PCR循環。PCR結束后，取2μl擴增產物進行電泳檢測。擴增的片段從小到大依次為113bp、143bp、199bp、253bp、303bp、406bp、501bp、576bp、710bp、802bp、903bp、989bp、1167bp、1300bp和1463bp。M, DNA marker (D0107 DNA Ladder (0.1-10kb, 21 bands))。圖中可見低至10pg的模板就可以擴增獲得15條非常單一明亮的條帶。

本產品兼容血液和植物樣品。全血或血清樣品無須進行DNA的提取和純化，即可直接作為模板用于本試劑盒的多重PCR檢測。本產品適用于EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血樣品或干血斑樣品。植物樣品也可以直接用于本試劑盒的多重PCR檢測，完全無須對植物樣品進行DNA的提取和純化。

本產品提供了陽性對照，便于驗證本產品的效果。本試劑盒提供了Control template and primer mix，預先混合了模板和引物，可以作為陽性對照用于驗證確認本產品的多重PCR擴增效果。Control template and primer mix中包含了15對引物，可以擴增出如圖1所示的從113bp-1463bp的共15個條帶。

本產品使用特別便捷。僅需添加引物、模板和水即可進行多重PCR，并且PCR結束后可以直接進行電泳檢測，無需添加上樣緩沖液。

本產品的擴增產物可以用于TA克隆。使用本產品獲得的PCR產物帶有3'-dA overhangs的粘性末端，可直接用于與T載體連接進行TA克隆。本產品中所使用的Multi? DNA polymerase的保真性和Taq DNA聚合酶相近，因此本產品主要推薦用于定性和半定量檢測。

本產品如果用于20μl的PCR反應體系，兩種包裝的本產品分別足夠用于100個和500個反應。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存。

注意事項：

引物設計對于多重PCR的成功與否至關重要。引物的設計一方面需要滿足常規的引物設計規則，避免出現非特異性擴增和無法擴增，設計好的引物對應逐一通過PCR驗證，然后才能選擇效果較好的引物對用于多重PCR。并且引物的設計在盡可能的情況下，如果Tm值按照Tm = 2n(A) + 2n(T) + 4n(C) + 4n(C)進行計算(例如一條引物含有3個A、7個T、4個G和6個C，那么Tm = 2X3 + 2X7 + 4X4 + 4X6 = 60)，Tm值不能低于60℃，通常按此計算Tm不低于65℃時用于多重PCR的效果會更佳。

推薦使用高質量引物(經脫鹽處理、PAGE或HPLC純化)，建議使用前預先混合所用所有引物對，調整各對引物母液濃度均達到10μM，最終使其在PCR反應體系中終濃度達0.2μM。

推薦的延伸速度為2min/kb，對于較難擴增的靶序列，可適當調整延伸時間為3-4min/kb。

如果PCR產物條帶較多，建議PCR反應后電泳檢測的上樣量調整為約2μl，過多的上樣量容易導致電泳條帶不太平整。

由于多重PCR反應非常靈敏，在使用本產品時請注意避免微量待擴增DNA的污染，建議設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。

需自備Nuclease-Free Water。推薦選購ST876 Pure? Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。

對模板GC含量過高的情況，推薦使用D7301 Multi? Multiplex PCR Kit并和D7303 Multi? PCR Enhancer (2X)配套使用。

本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.引物設計：
引物設計對于成功進行多重PCR至關重要，建議使用適當的引物設計軟件進行引物設計：
a.引物的長度通常為20-30個核苷酸。
b.GC含量為40-60% (優選45-55%)。
c.避免所用的多個引物的3'末端出現互補序列，避免引物3'末端有3個或更多的G / C，避免引物內的二級結構。
d.在盡可能的情況下所用引物的Tm值應不低于60℃，推薦在Tm值在65-68℃之間更佳，引物間的Tm值差異應控制在5-6℃以內。此處提到Tm值按照Tm = 2n(A) + 2n(T) + 4n(C) + 4n(C)進行計算，例如一條引物含有3個A、7個T、4個G和6個C，那么Tm = 2X3 + 2X7 + 4X4 + 4X6 = 60。
e.建議擴增的目標片段不超過1500bp。雖然目標片段大約1500bp時也能被很好地擴增，但過長的片段和較短的片段同時進行PCR擴增的時候，相對更容易產生亮度不太均勻的條帶。
f.建議使用經過脫鹽、PAGE或HPLC純化的引物，并溶于TE buffer (10mM Tris-Cl,1mM EDTA, pH 8.0)。
2.引物的配制：
每種合成的引物推薦配制為100μM，然后每個引物對1:1混合并加入適量水配制成10μM的引物對。例如，如果合成得到的一個5’端引物A的量是20nmol，另外一個相應的3’端引物B的量是19nmol。在引物A中加入200μl水或TE，配制成濃度為100μM，在引物B中加入190μl水或TE也配制成濃度為100μM。吸取20μl 100μM引物A和20μl 100μM引物B到一新的離心管中，再加入160μl水，混勻后即可得到可以直接用于多重PCR的引物對(10μM each)。
3.多重PCR擴增:
a.反應體系的設置。融解并混勻Easy-Load? Multiplex PCR Master Mix (2X)，置于冰浴上或冰盒內。參考下表設置PCR反應體系?？筛鶕闆r，將多對引物進行等濃度預混合。

注1：n代表多重PCR時使用的引物對種類的數量，即擬擴增片段種類的數量。
注2：關于模板使用量。DNA模板的用量對PCR擴增有很大影響。對于高復雜度的DNA樣本，如哺乳動物基因組DNA，推薦在20μl反應體系中使用5ng至0.5μg模板DNA。對于低復雜度的DNA，如λDNA或質粒DNA，推薦在20μl反應體系中使用5pg至5ng的模板DNA。
注3：關于PCR模板為抗凝血的情況。PCR模板為抗凝血時，模板的用量一般為PCR反應體系總體積的1-20%，建議起始使用量為5%；如果抗凝血多重PCR反應檢測的是基因組的DN**段，可以適當減少抗凝血用量；如果抗凝血多重PCR反應檢測的是血液樣品中某種病毒或細菌等微生物的目的DN**段，建議使用50μl的PCR體系，并使用較大的模板血量。對于高GC含量的PCR擴增，推薦使用D7301 Multi? Multiplex PCR Kit并和D7303S Multi? PCR Enhancer (2X)配套使用，或者嘗試向PCR體系中加入終濃度1-10% (體積百分比)的DMSO。對于干血斑樣品，20μl和50μl的PCR體系中分別推薦使用約0.8平方毫米和2平方毫米的干血斑。
注4：關于PCR模板為植物樣品的情況。PCR模板為抗凝血時，對于20μl和50μl PCR反應體系，植物樣品的推薦用量分別為0.1-1mm和0.3-3mm直徑葉片或類似大小其它比較柔嫩的植物組織。如果模板為植物種子，盡量使用鮮嫩的植物種子。用干凈的解剖刀去掉種子外殼，剪下直徑約0.5-2mm的組織直接放入PCR管內；若種子太小，如番茄種子，可直接使用1-2粒完整的種子放入PCR管內進行擴增。50μl PCR體系，植物葉片或是種子直徑不宜超過3mm，太多模板易造成PCR抑制成分偏多，影響PCR效果。推薦取兩份植物組織樣品進行平行的PCR實驗，以降低取樣的不穩定性。為確保取樣的均一性，建議使用專用的打孔器或解剖刀進行取樣，并注意防止取樣過程中的交叉污染。每一次取樣，可以用2%的次**鈉溶液清洗打孔器或解剖刀。對于高GC含量的PCR擴增，可以嘗試向PCR體系中加入終濃度1-10% (體積百分比)的DMSO。
注5：關于引物濃度。通常引物的終濃度為0.2μM時可獲得良好的PCR擴增效果，但也可以根據情況在0.05-0.4μM范圍內調整引物的終濃度。擴增效率低的情況下，可提高引物濃度；發生非特異性擴增時，可降低引物濃度。
b.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數秒，使液體積聚于管底。
c.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))。
d.把設置好的PCR反應體系置于PCR儀上，開始PCR反應。PCR反應的設置可以參考如下表格。

注1：需根據每次反應的模板、引物、PCR產物的長度和GC含量等適當優化PCR反應條件，包括退火溫度、退火時間、循環數等。通常退火溫度可在55-60℃范圍內適當調整，或者可以對退火溫度采用Touch down的方式，確保退火效果良好。
注2：對于初次進行的PCR，為盡量確?？梢詳U增出預期的PCR產物，可以把循環數設置為35。后續可以根據實際的PCR效果適當調整循環數。
4.電泳檢測。多重PCR反應結束后，即可進行常規的凝膠電泳檢測(對于植物等比較特殊的樣品，如有必要，可以離心取上清進行電泳)。陽性對照的檢測結果可以參考圖1。
常見問題：
1.PCR產物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當的引物設計軟件進行引物設計，注意引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴增片段GC含量偏高。推薦使用D7301 Multi? Multiplex PCR Kit并和D7303S Multi? PCR Enhancer (2X)配套使用。
c.部分目的片段過長。盡管Multi? DNA Polymerase可以擴增最長達5kb的DN**段，但在多重PCR時，大多數時候更適合擴增1.5kb以下的片段。過長的目的片段不太適合在多重PCR時進行擴增。
d.引物的二級結構、引物二聚體或引物偏短會導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火溫度不佳，需要優化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的最佳溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索最佳的退火溫度。
f.延伸時間不足。可按照每1kb片段延伸2分鐘進行設置，對于較難擴增的片段可以設置為每1kb片段延伸3-4分鐘。
g.在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現問題。
h.循環數不足，適當延長PCR的循環數。通常循環數最高不必超過40，常用的循環數范圍為30-40。
i.模板用量偏少，可以適當加大模板用量。
j.對PCR引物進行脫鹽甚至PAGE膠或HPLC純化。
k.使用高質量的dNTP混合物。
l.適當增加Multi? DNA polymerase的用量。
m.當產生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
n.注意設置本產品提供的Control template and primer mix作為陽性對照，以確認整個多重PCR體系可以正常工作。
o.確保沒有漏加任何PCR反應的組分。
2.雜帶較多或條帶彌散。
a.退火溫度提高 2-5°C。
b.適當檢測PCR的循環數。
c.適當減少模板的用量。
d.在室溫配制PCR體系容易產生非特異性條帶。推薦在冰浴上配制PCR反應體系。
e.適當減少Multi? DNA polymerase的用量，或推薦使用D7301 Multi? Multiplex PCR Kit并和D7303S Multi? PCR Enhancer (2X)配套使用。
f.適當縮短延伸時間。?