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?大家好，小編又又又來了。今天是WB最后一步了，抗體孵育到顯影過程。

一抗孵育

◆?封閉結束前20min準備和所需一抗數量相等的孵育盒，在孵育盒上用記號筆標注出抗體編號及所需稀釋比。按照規定的稀釋比例進行抗體稀釋。稀釋比例建議預實驗提前摸索或者根據抗體說明書上建議。

◆?封閉時間結束之后，倒掉封閉液，將稀釋好的抗體加入到槽內，將搖床放入4℃展示柜孵育過夜。

◆?第二天將搖床搬出，平衡室溫搖15min，倒掉一抗工作液，加入5mL TBST潤洗膜一次，倒掉，加新的TBST洗膜5min，倒掉TBST，重復5次，此過程在搖床上進行。

二抗孵育

◆?在洗膜的過程中稀釋二抗，確定好一抗的物種來源，選擇相應的二抗進行稀釋，稀釋液為1xTBST。

◆?洗膜結束，倒掉TBST，盡量使孵育盒內無殘留液體。然后加入二抗稀釋液，孵育60min，此過程在搖床上進行。

◆?二抗孵育60min后，加入5mL TBST洗膜，“SPEED”檔位調到50-60，洗膜5min，倒掉TBST，重復5次。

顯影

按照膜的大小，配置ECL發光液體積，將發光液放在PE手套上，充分混勻。將膜從孵育盒中夾出，用紙沾干，放入發光液中5秒后用紙沾干，放入成像儀中曝光成像。

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