人巨噬細胞炎性蛋白 3αELISA 試劑盒
產品編號：SEKH-0249
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本
背景介紹：
? ? ? ?MIP-3α(又稱肝激活調節趨化因子)是一種具有選擇性趨化淋巴細胞和樹突狀細胞趨化活性的 CC 趨化因子， MIP-3α全長 cDNA 編碼 96 個氨基酸，與其他人 cc 趨化因子同源性較低，與 MIP-1β同源性最高(28%)，人 MIP-3α與小鼠 MIP-3α同源性為 64%，MIP-3α含有 4 個保守的半胱氨酸殘基，在 5 個高度保守的氨基酸殘基中有 3 個氨基酸同源性較高。在 cc 趨化因子中，其它 cc 趨化因子中第二和第三半胱氨酸殘基之間的酪氨酸和蘇氨酸殘基分別以苯丙氨酸和丙氨酸取代于 MIP-3α，MIP-3α也不同于其他 cc 趨化因子，它定位于人類第 2 號染色體和第 17 號染色體。MIP-3α由單核細胞、T 細胞、內皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞等活化細胞產生，在肝、肺和部分淋巴組織中均有表達，其中以炎癥組織和黏膜組織中 MIP-3 α表達為主，多種細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1β、CD 40 配體、IFN-γ和 IL-17 均可誘導 MIP-3 α蛋白的表達，肉豆蔻酸佛波酯也可誘導多種細胞株 MIP-3α的表達。MIP-3α可能通過自分泌和/或旁分泌機制參與多種疾病的病理生物學研究，MIP-3α和 ccr 6 在銀屑病細胞表面的表達明顯上調，提示 MIP-3α與受體之間的相互作用對 T 細胞對銀屑病皮膚的 T 細胞再生有重要作用。?
? ? ? ?MIP-3α(又稱肝激活調節趨化因子)是一種具有選擇性趨化淋巴細胞和樹突狀細胞趨化活性的 CC 趨化因子， MIP-3α全長 cDNA 編碼 96 個氨基酸，與其他人 cc 趨化因子同源性較低，與 MIP-1β同源性最高(28%)，人 MIP-3α與小鼠 MIP-3α同源性為 64%，MIP-3α含有 4 個保守的半胱氨酸殘基，在 5 個高度保守的氨基酸殘基中有 3 個氨基酸同源性較高。在 cc 趨化因子中，其它 cc 趨化因子中第二和第三半胱氨酸殘基之間的酪氨酸和蘇氨酸殘基分別以苯丙氨酸和丙氨酸取代于 MIP-3α，MIP-3α也不同于其他 cc 趨化因子，它定位于人類第 2 號染色體和第 17 號染色體。MIP-3α由單核細胞、T 細胞、內皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞等活化細胞產生，在肝、肺和部分淋巴組織中均有表達，其中以炎癥組織和黏膜組織中 MIP-3 α表達為主，多種細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1β、CD 40 配體、IFN-γ和 IL-17 均可誘導 MIP-3 α蛋白的表達，肉豆蔻酸佛波酯也可誘導多種細胞株 MIP-3α的表達。MIP-3α可能通過自分泌和/或旁分泌機制參與多種疾病的病理生物學研究，MIP-3α和 ccr 6 在銀屑病細胞表面的表達明顯上調，提示 MIP-3α與受體之間的相互作用對 T 細胞對銀屑病皮膚的 T 細胞再生有重要作用。?
檢測原理：
? ? ? ?Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯免疫吸附檢測技術。將抗人 MIP-3α/CCL20 單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本，標準品和樣本中的人MIP-3α/CCL20 會與酶標板上的包被抗體充分結合；洗板后加入生物素化抗人 MIP-3α/CCL20 抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的人 MIP-3α/CCL20 發生特異性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發生高強度的非共價結合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的人 MIP-3α/CCL20，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關）的藍色物質，加入終止液后反應孔會變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣品吸光度（OD），樣本中的人 MIP-3α/CCL20 濃度與 OD 成正比，通過繪制標準曲線和四參數擬合軟件便可計算出樣本中人 MIP-3α/CCL20 的濃度。
原理圖：
注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持一致。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
? ? ? ?Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯免疫吸附檢測技術。將抗人 MIP-3α/CCL20 單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本，標準品和樣本中的人MIP-3α/CCL20 會與酶標板上的包被抗體充分結合；洗板后加入生物素化抗人 MIP-3α/CCL20 抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的人 MIP-3α/CCL20 發生特異性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發生高強度的非共價結合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的人 MIP-3α/CCL20，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關）的藍色物質，加入終止液后反應孔會變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣品吸光度（OD），樣本中的人 MIP-3α/CCL20 濃度與 OD 成正比，通過繪制標準曲線和四參數擬合軟件便可計算出樣本中人 MIP-3α/CCL20 的濃度。
原理圖：
注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持一致。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。?
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。?
安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規定執行。
試劑盒組成及儲存：
自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的最高值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。
試劑準備：
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標準品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度進行2倍稀釋：500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8pg/ml進行稀釋，2000pg/ml為標準曲線最高點濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
試劑盒組成及儲存：
自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的最高值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。
試劑準備：
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標準品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度進行2倍稀釋：500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8pg/ml進行稀釋，2000pg/ml為標準曲線最高點濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。
5. 酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。
6. 洗滌方法：
? 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔，注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
? 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
檢測步驟：
5. 酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。
6. 洗滌方法：
? 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔，注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
? 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
檢測步驟：
結果判斷：
1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。
2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值。
3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中MIP-3α/CCL20含量可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。
參數表征：
1. 數據及標準曲線
本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人 MIP-3α/CCL20 的樣本含量。
2. 靈敏度：
最低可檢測人 MIP-3α/CCL20 濃度達 4pg/ml，
20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。
3. 特異性：
不與人 GROβ、 GROγ 、HCC-4、 MCP-1、 MIP-1α、 MIP-1β、 MIP-1γ、 MIP-3β，小鼠 6Ckine、 MIP-3α 、MIP-3β等反應。
4. 重復性：
板內，板間變異系數<10%。
5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細胞培養上清中加入 3 個不同濃度水平的人 MIP-3α/CCL20，計算回收率。
6. 線性稀釋：
分別在選取的 4 份健康人血漿和細胞培養上清中加入高濃度人 MIP-3α/CCL20，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。
