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酶聯免疫吸附測定enzyme linked immunosorbent assay（簡寫ELISA），指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。要知道elisa操作步驟首先我們先了解一下elisa的原理是什么。

elisa的原理：

①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性， 又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體 上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物， 產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據焰色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到 很高的敏感度。

elisa操作步驟：

方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越 強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則 410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

方法二　用于檢測未知抗體的間接法：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日 洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應孔 中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體

以上是elisa操作步驟，那么在elisa操作步驟的操作步驟中需要注意什么呢？下面是elisa實驗的注意事項：

1.正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2.在elisa操作步驟中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：固相載體的選擇、包被抗體(或抗原)的選擇、酶標記抗體工作濃度的選擇、酶的底物及供氫體的選擇