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細胞外囊泡（EVs）是細胞衍生出的膜結構囊泡，如外泌體、微囊泡和凋亡小體等。由于在囊泡腔內包裹著或在顆粒表面修飾著豐富的成分，EVs在治療各類危及生命的疾病方面有巨大潛力。通常情況下，源于免疫細胞外泌體對腫瘤表現出不同的免疫治療效果。另外，由于其天然獨特的特性，EVs在藥物遞送方面表現出卓越的性能，包括但不限于固有穩定性、生物膜透性、低免疫原性和歸巢能力。前人研究證明，裝載阿霉素的外泌體對乳腺癌細胞有靶向細胞毒性作用，且與游離藥物相比，心臟毒性和副作用更小。另外一個研究表明，裝載紫杉醇的外泌體對多藥耐藥肺癌有良好的治療效果。外泌體甚至能夠通過血腦屏障遞送藥物，為神經系統疾病提供了可能的解決方案。除了有效的體內外實驗結果外，將外泌體作為藥物載體有著巨大的轉化潛力。源于間充質干細胞的外泌體裝載KRAS G12D siRNA后對胰腺癌的治療效果正進行Ⅰ期研究。盡管前景廣闊，但它們距離全面臨床轉化階段還很遠。一個最重要的原因就是大多數EVs由于其納米直徑被保留在網狀內皮系統中，然后被單核巨噬細胞和其他細胞吸收。為了提高藥物遞送精度和減少副作用，在目標組織處通過EVs釋放特定藥物非常可取，但具有挑戰性。

在過去的幾十年里，光動力療法（PDT）由于其突出的優勢，已成為癌癥治療的新模式，比如時空可控性、最小侵入性、高效性和低毒性。該療法已被證實對多種有效，且目前幾種光敏劑已被美國食品和藥物管理局批準用于治療某些癌癥。此外，該療法與其他治療方法結合，可進一步提高治療效果（比如光熱療法、放射療法、免疫療法和基因療法）。PDT與PDL-1檢查點阻斷免疫療法的協同作用，不僅可以消除原發性腫瘤，而且可以觸發系統性的腫瘤特異性細胞毒性T細胞反應，從而完全抑制未治療的轉移瘤。即便如此，PDT對深部腫瘤的治療效果受到激發光透性差、效率低的嚴重影響。作為一個有吸引力的替代方案，光敏劑通過原位化學反應產生化學能的激發不受透性的限制。Yu等通過構建基于化學發光共振能量轉移的仿生納米反應器，制定的光動力-饑餓協同治療策略對深部轉移瘤表現出良好的治療效果。然而，由于化學能通常是H₂O₂與過氧草酸酯衍生物反應產生的，此類化學激發PDT嚴重依賴于過氧化氫。盡管與正常組織相比，腫瘤微環境中的H₂O₂水平升高，但持續的反應會迅速耗盡腫瘤組織局部的H₂O₂供應，PDT的治療效果將明顯受限。為了提高化學激發的PDT效率，需要在腫瘤微環境中充分補充H₂O₂。然而，H₂O₂增強劑的可靠性以及增強劑與光敏劑(PSs)共同遞送到腫瘤的有效策略仍然十分有限。

該研究構建了自激活自發光的EVs遞送系統，同時展示三種協同抗癌治療模式。源于M1巨噬細胞的EVs（M1 EVs）和雙[2,4,5-三氯-6-（戊氧羰基）苯基]草酸酯（CPPO），二氫卟酚e6（Ce6）共同孵育后，用多柔比星原藥aldoxorubicin（Dox-EMCH）進行電轉化，以獲得裝載CPPO、Ce6和Dox-EMCH的EVs（M1CCD）。系統給藥后，由于M1 EVs天然的靶向能力，制備的M1CCD在腫瘤中不斷積累，而M1 EVs有效地將促腫瘤的M2巨噬細胞重新誘導為抗腫瘤的M1巨噬細胞，不僅表現出免疫治療活性，而且產生H₂O₂。CPPO與增多的H₂O₂反應，產生的化學能在沒有光激發的情況下直接激活光敏劑Ce6，產生用于成像的化學發光和用于PDT的單線態氧（¹O₂）。與此同時，由¹O₂引起的膜破裂導致前藥Dox-EMCH釋放，隨后在酸性微環境中被迅速激活轉化為毒性阿霉素（Dox），并滲透到腫瘤深部的低氧組織。免疫療法，光動力療法和化學療法的協同作用產生了強大的抗癌效果和較小的副作用。這種智能工程化的EV遞送系統作為癌癥治療候選方案非常有前景。

基本信息

摘 要

細胞外囊泡（EVs）在疾病治療和藥物遞送方面都具有巨大潛力。然而，準確地從細胞外囊泡釋放藥物，以及細胞外囊泡和藥物在目標組織處的自發治療效果協同作用仍然具有挑戰性。本研究報道了一種工程化的自激活光-EV，用于協同三模式抗癌治療。M1巨噬細胞衍生的細胞外囊泡（M1 EVs）同時裝載CPPO，Ce6和Dox-EMCH。給藥后，由于M1 EVs的腫瘤歸巢能力，制備的該系統可主動靶向腫瘤，其中M1 EVs將M2重新極化為M1巨噬細胞，不僅顯示出免疫療法的作用，而且進一步提高腫瘤微環境中的H₂O₂。H₂O₂和CPPO之間發生反應，產生化學能，激活Ce6，產生用于成像的化學發光和用于PDT的¹O₂。同時，由¹O₂引起的膜破裂導致Dox-EMCH釋放，被釋放的Dox-EMCH隨后被特異性激活并滲透到腫瘤的低氧組織。免疫療法，光動力療法和化學療法的協同作用可產生有效的抗癌功效，顯示出抗擊癌癥的巨大希望。

研究內容及結果

1. M1CCD具有自激活化學發光和¹O₂生成能力

小鼠原始腹腔巨噬細胞首先用1ug/mL脂多糖（LPS）處理24小時極化形成M1巨噬細胞，通過流式細胞術確定極化效果。隨后用經驗證的超速離心程序純化M1 EVs。EVs的磷脂雙分子層通過疏水作用將CPPO和Ce6包裹起來，形成的親水管腔裝載水溶性的Dox-EMCH。為了裝載盡可能多的藥物，首先，作者分別研究了M1 EVs（約10¹⁰細胞顆粒mL^-1）中CPPO、Ce6和Dox-EMCH的裝載能力，發現裝載飽和濃度分別為100、160和250 ug/mL。然后將相同數目的M1 EVs（約10¹⁰細胞顆粒mL^-1）用100 ug/mL的CPPO和160 ug/mL的Ce6孵育，用250 ug/mL的Dox-EMCH進行電轉化。通過CPPO、Ce6和Dox-EMCH紫外吸收光譜的特征吸收峰及其標志物的熒光成像效果驗證這些藥物是否成功裝載（圖2a,b）。每1×10¹⁰M1 EVs顆粒（n=6）CPPO、Ce6和Dox-EMCH的裝載量分別為16.7±0.8,5.4±0.3,12.7±0.5ug。與原始M1 EVs相似，M1CCD的形態為典型的杯狀（圖2c），且裝載藥物后其Zeta電位幾乎不變。M1CCD的水動力學尺寸為165±31nm（n=6），與原始M1 EVs相比增加了約36nm。M1CCD可在鹽酸鹽緩沖液（PBS）或10%胎牛血清中保存一周，顯示出良好的穩定性（圖2d，e）。

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