研發生產的小RNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(Small RNA 3′-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)，是一種提供了5’腺苷化和3’封閉的Universal miRNA Cloning Linker及相應的連接酶和配套試劑，用于miRNA等3’端為羥基的小RNA和接頭連接的試劑盒。3’端連接了接頭的小RNA后續可以用于其克隆、高通量測序建庫或PCR檢測等。

本試劑盒也可以用于3’端為羥基的單鏈DNA和接頭的連接，因此也可以稱為單鏈DNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(ssDNA 3'-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)，或核酸3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(3’-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)。

本試劑盒提供的Universal miRNA Cloning Linker，其5′端腺苷酰化(也稱5'端預腺苷?；?'端預腺苷化，5'pre-adenylated或5'pre-adenylation)，3'端氨基封閉，可以用于3’端為羥基的RNA的3’端接頭的添加。本試劑盒中提供的T4 RNA Ligase2, truncated可以識別“活化”的5′端腺苷?；腢niversal miRNA Cloning Linker，在無需ATP存在的條件下，可將Universal miRNA Cloning Linker的5′端與另外一條單鏈寡核苷酸的3′端羥基共價連接。

使用本試劑盒和miRNA連接時，可以有效避免miRNA的自連、不同miRNA之間的連接、Linker的環化或Linker分子之間的連接，而僅發生Linker 5'端和miRNA 3'羥基之間的特異性連接。

本試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效果請參見圖1。

圖1. 生產的小RNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)和ssRNA的效果圖。反應體系為20μl，Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)的終濃度為1μM，單鏈RNA的終濃度為0.5μM，反應條件為25℃孵育60min，反應完畢后立即取樣在65℃孵育20min終止反應，加入變性上樣緩沖液并在95℃孵育5min后放至冰浴中，隨后用15%尿素(7M)變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，最終進行核酸染色和熒光成像分析。如圖所示，本試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效率非常高。

本試劑盒提供的Universal miRNA Cloning Linker的序列是：5′-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3′。該序列同NEB公司的S1315S Universal miRNA Cloning Linker。

本試劑盒如果用于20μl的反應體系，并按照本試劑盒推薦的連接體系，可以用于20次的Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的連接反應。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，至少一年有效。

注意事項：

本試劑盒附帶提供的試劑均用DEPC水配制，可直接用于底物為單鏈RNA (3’端需為羥基)和Universal miRNA Cloning Linker (5′ adenylated, 3′ blocked) 的連接反應。

使用本試劑盒連接ssRNA和Universal miRNA Cloning Linker (5′ adenylated, 3′ blocked)時，建議使用的PEG8000的濃度為10% -30%，適當提高PEG8000的濃度，會顯著提高連接效率。

可根據具體應用選擇合適的操作方法，可能需準備額外的試劑，如RNase inhibitor、DEPC水等。

根據連接反應的類型，推薦在反應體系中加入適量的PEG8000。建議RNA環化反應體系中PEG8000的終濃度為10%，連接單鏈RNA或DNA的分之間連接反應體系中PEG8000的終濃度為15%-25%，這樣可以顯著提高酶活性，同時不影響反應特性。

本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.用于連接Universal miRNA Cloning Linker和單鏈RNA (ssRNA)的3’羥基末端時，參考下表在冰浴中配制如下反應體系：

注意：
a.由于涉及RNA操作，需要嚴格按照RNA操作的規范進行，避免RNase污染，相關試劑和耗材需要經過DEPC處理去除RNase或者確保是RNase free的。推薦在連接體系中添加RNase inhibitor，以避免ssRNA或其連接產物的降解，盡管經測試我們發現在嚴格操作的情況下，不加RNase inhibitor也不會導致ssRNA或其連接產物發生明顯降解。
b.進行連接反應時，通常推薦ssRNA和linker按照1:1進行連接反應，以適當節約本試劑盒。如果樣品RNA比較珍貴，希望充分被連接，可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比為2:1的比例進行連接；如果樣品RNA比較充裕，同時感覺本試劑盒的成本偏高時，可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比摩爾比1:1甚至1:2的比例進行連接反應，這樣可以很好地節省本試劑盒。
c.如果同時進行多個連接反應，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前預混合，然后再分裝到各反應管內。
2.連接反應：25℃, 孵育60min。為了使連接反應更加充分，可以適當延長連接反應時間。
3.終止反應：65℃，孵育20min。?