實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——取材
| 組織來源 | 操作步驟 |
| 皮膚和粘膜 | 主要取皮片，面積一般2~4平方厘米。 |
| 血液細(xì)胞 | 一般多抽取靜脈外周血或從淋巴組織中(如脾扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等)分離細(xì)胞取材時(shí)應(yīng)注意抗凝。 |
| 雞(鴨)鳥類胚胎組織 |
1.取孵化至適當(dāng)杯齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管，胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。 |
| 內(nèi)臟和實(shí)體瘤 |
1.無菌環(huán)境。 |
| 骨暗、羊水、胸/腹水細(xì)胞 | 嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。 |
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動(dòng)物組織取材: 鼠胚組織 |
1.用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物。 |
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動(dòng)物組織取材: 幼鼠胚腎(或肺) |
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)，采用無菌法打開胸腔取肺，或從背部打開腹腔取腎。 |
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?組織塊培養(yǎng)法
1. 組織塊接種后的前3天，在觀察和移動(dòng)的過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動(dòng)和振動(dòng)，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。
2. 加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動(dòng)而脫落下來。
3. 當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)。
4. 為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。
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? 貼壁型原代細(xì)胞
1. 原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時(shí)，它們之間會(huì)互相影響，在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長(zhǎng)。如果接種的細(xì)胞密度過低，細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細(xì)胞密度過大，會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。
2. 適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用，會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng)。
3. 盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。可以在接種后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，待細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
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?懸浮型原代細(xì)胞
1. 必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。可以通過增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液，以5ml為最低限度，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞。
2. 能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，換液時(shí)間隔一般較短。
原代細(xì)胞培養(yǎng)問題
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? 原代細(xì)胞與細(xì)胞系有什么區(qū)別？
1.根據(jù)傳統(tǒng)定義，自組織第一次收獲和接種的細(xì)胞被稱為原代細(xì)胞。這類細(xì)胞直接從組織分離，生命周期有限，經(jīng)數(shù)次傳代后會(huì)逐漸停止生長(zhǎng)。原代細(xì)胞在有限的生命周期內(nèi)需掌握好細(xì)胞的最大生長(zhǎng)空間，以保持細(xì)胞群中基因型和表型的一致性。
細(xì)胞系是不斷生長(zhǎng)、分化的細(xì)胞群，因其經(jīng)過遺傳改造，致使其具有無限增長(zhǎng)的潛能。體外生長(zhǎng)的細(xì)胞系用于醫(yī)療或科研。
但實(shí)際上，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)的傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞系隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞的基因型和表型都有可能發(fā)生改變。
需要指出的是，在不同的科研小組中這些術(shù)語的定義會(huì)有所不同。許多研究員不用細(xì)胞系這個(gè)詞表示細(xì)胞群，除非細(xì)胞經(jīng)過了遺傳改造。
2. 能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，換液時(shí)間隔一般較短。
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? 倍增和代數(shù)有什么區(qū)別？
倍增是培養(yǎng)物中細(xì)胞總數(shù)的翻倍，通常是指細(xì)胞指數(shù)或?qū)?shù)生長(zhǎng)期。代數(shù)是指細(xì)胞群從培養(yǎng)瓶中移出，傳代培養(yǎng)過程的次數(shù)，傳代培養(yǎng)的目的，是使細(xì)胞處于低密度以刺激其進(jìn)一步生長(zhǎng)。
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? 接收到的凍存細(xì)胞該如何處理？
收到包裝箱后，立即將凍存細(xì)胞從干冰移入液氮中凍存。此過程盡量快，以避免升溫。不要將細(xì)胞儲(chǔ)存在-80℃，這樣會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可挽回的傷害。
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? 凍存的細(xì)胞該如何開始培養(yǎng)？
1. 將一管細(xì)胞從液氮罐中取出，注意保護(hù)手和眼睛。
2. 將凍存管快速的放入37℃水浴中，輕輕握住并旋轉(zhuǎn)，直到管內(nèi)物體完全融化。
3. 將凍存管立即從水浴中拿出，擦干，轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境。
4. 用70％的酒精沖洗凍存管，然后擦去多余酒精。
5. 打開蓋子，注意手指不要碰到里面的螺紋（注意，由于凍存管有負(fù)壓，開蓋時(shí)可能會(huì)有少量溢出，這是正常現(xiàn)象）。
6. 用多聚賴氨酸（或參照說明書）包被培養(yǎng)瓶。多數(shù)細(xì)胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個(gè)細(xì)胞。
7. 蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以使細(xì)胞分布均勻。若需要?dú)怏w交換可打開蓋子。
8. 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2，95%空氣）
9. 放入培養(yǎng)箱后第6-16小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，以去除殘留的二甲基亞砜和未貼壁的細(xì)胞。
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? 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，多久更換一次培養(yǎng)基？
這取決于細(xì)胞生長(zhǎng)的速度。一般而言2-3天更換一次培養(yǎng)基，許多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室通常在周一，周三，周五更換培養(yǎng)基。
注意：凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，在6-16小時(shí)內(nèi)更換培養(yǎng)基，以去除殘留的二甲基亞砜和死亡的細(xì)胞。
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?我能擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存原代正常人類細(xì)胞嗎？
這取決于細(xì)胞的類型。
一些細(xì)胞類型像神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和一些生長(zhǎng)緩慢的上皮細(xì)胞，不推薦擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存。
其它的細(xì)胞類型像成纖維細(xì)胞、星形細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等等，可以擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存。
然而，需要注意的是再次凍存的過程可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)性能的改變。
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? 培養(yǎng)瓶中應(yīng)該加入多少體積的培養(yǎng)基？
我們推薦的用量為：
Nest T-25培養(yǎng)瓶5mL
T-75培養(yǎng)瓶15mL
T-225培養(yǎng)瓶50mL
