M.?Kenrick,?S.?Hancock,?S.?Stubbs,?and?N.?Thomas
GE?Healthcare,?The?Maynard?Centre,?Cardiff,?UK
?
?
近來關于siRNA技術和諸如IN?Cell?Analyzer的高通量成像分析平臺的發展對于基因組和蛋白組的功能分析起著革命性的推動作用。在此，我們將會介紹兩種能夠穩定表達綠熒光蛋白（GFP）細胞周期感受器的細胞株在篩選siRNA分子庫中的應用，這種篩選得到的分子庫將被用于抑制細胞周期的核心調控基因。通過全自動的圖像分析系統對這兩種細胞株的中GFP熒光強度和分布狀態進行成像檢測，得到熒光在細胞周期各個過程中的分布，該結果能夠幫助科學家篩選通過封閉細胞周期起作用的藥物。???
?
介紹
?
合成和病毒編碼的siRNA技術已經發展到了一個新的高度(1,?2)，大量的RNAi篩選已經能應用于哺乳動物細胞?(3–5)。除了保證有大量有效的siRNA外，高效的哺乳動物siRNA功能篩選更加需要高信息含量的系統模式，從而使實驗數據中能夠提取的多重參數通量水平和巨大的研究課題數量相一致。
?
可喜的是，熒光成像系統和分析軟件的發展已經跟上了siRNA的發展速度，目前的技術已經能夠對活細胞形態發生進行高通量的成像和分析(6,?7)。相應的儀器能夠通過整合熒光細胞感受器和細胞形態學的數據，提供在細胞篩選中siRNA的詳細表性變化信息，從而對復雜多變的生物系統進行研究。
?
在本研究中，我們研究了兩種能夠穩定表達綠熒光蛋白（GFP）細胞周期感受器的細胞株(8–10)，它們能被用來篩選抑制細胞周期核心調控基因的siRNA分子庫(圖?1)。
?
siRNA?篩選
?
使用包含112個siRNA庫的Dharmacon?siARRAY?對細胞周期基因進行敲除，其中每個庫都包括了能夠抑制單一細胞周期相關基因4種siRNA，并把隨機編碼和用Cy?5標記的siRNA作為對照以確定轉染效率。siRNA轉染至G2/M和G1/S細胞周期階段標記（Cell?Cycle?Phase?Marker?，CCPM）的細胞并于U2OS細胞表達。實驗方法的詳細描述可參考本文的完整版。
?
細胞成像使用GE?Healthcare的IN?Cell?Analyzer?1000，20倍物鏡，475BP20/535BP50?(GFP)?和
620BP60/700BP75?(DRAQ5)?激發/散射濾光片。得到的圖像數據被轉換成IN?Cell?Analyzer?3000的數據格式，并通過圖像對細胞數目、細胞周期分布和細胞形態學進行了分析。
?
結果
?
通過對G1/S?CCPM細胞的分析，得到了在G1至S期過程中，敲除剪切型細胞周期調節因子cyclin?E的影響性的精確定量。對照的G1/S?CCPM細胞表現出的可分解的細胞比率(76%)和對照的G2/M?CCPM細胞相一致(74%)，其中9%為G1期細胞，67%為S期細胞。敲除了cyclin?E后，在G1和S期的相關細胞總體比率仍舊維持在76%，同樣的結果也在G2/M?CCPM細胞中被觀察到。然而，值得注意的是這兩個時期之間的平衡卻發生了變化，G1期細胞升高至27%，S期細胞降低為49%，這揭示了cyclin?E在細胞從G1期向S期轉變過程中的作用。
?
先前的研究表明，用siRNA敲除polo-like激酶（PLK）能夠抑制細胞增殖，使細胞停留在有絲分裂階段，并且誘導細胞凋亡(11)。用抑制PLK的siRNA處理G2/M?CCPM細胞并進行細胞周期分析，發現用50?nM?siRNA轉染48小時后，有絲分裂的細胞數目發生了明顯的增加(圖3B)。通過對G1/S?CCPM?(圖3A)?和G2/M?CCPM（數據未給出）的分析證實了細胞對PLK被敲除后的極度敏感性，在5?nM?siRNA處理下，G2和M期的細胞數量發生了增長，相應的，G1期細胞數量發生了下降。
?
使用DNA粒度對所有通過siRNA庫篩選得到的圖像數據進行再次分析，結果表明PLK?siRNA在本研究中對于敲除基因從而誘導凋亡的過程起著最為重要的作用(圖3C)。??
?
結論?
?
--通過siRNA對敏感和動態的細胞表型研究進行干擾，為細胞周期的功能分析提供了強有力的工具。
--高通量亞細胞成像和全自動多重參數圖像分析為篩選和研究siRNA的基因敲除作用提供了一個高內涵的分析環境。
圖1.?G2/M?和?G1/S?細胞周期階段標記(CCPM)構建和細胞株.?在設計好的細胞周期對照及應答原理的調控下，GFP融合蛋白的表達、定位和降解為在活細胞的周期中定位蛋白提供了可能。cyclin?B1啟動子在S期晚期啟動EGFP表達，并由此調控表達G2/M?CCPM。當細胞周期到達G2期時，細胞質中的EGFP信號強度增長，而細胞周期早期熒光信號主要集中在核上。GFP信號在有絲分裂期強度達到最大值，隨即由于cyclin?B1破壞盒(D-box)的調控而迅速下降，于是在下面的2個G1期子細胞上就得不到熒光信號。G1/S?CCPM通過泛素C啟動子的作用而表達，在整個細胞周期中GFP融合蛋白的表達水平都較低。在G1期，融合蛋白大都位于細胞核中，在進入S期過程中，PSLD區域的磷酸化作用介導蛋白向細胞質中轉運，從而在G2期整體改變了融合蛋白在細胞核/細胞質中的分布。
??
?
圖2.?Cyclin?E?siRNA阻斷了G1期向S期的變化。用直接抑制cyclin?E的siRNA?pool轉染G1/S?CCPM細胞，經過24小時后，以BrdU刺激細胞1小時，通過細胞增殖熒光法檢測BrdU的整合作用。G1和S期的細胞通過用目標密度圖像分析進行數量測定。G1期細胞為綠色，S期細胞為紅色。
??
?
圖3.?以PLK?siRNA阻斷細胞周期并誘導凋亡。（A）5?nM?PLK?siRNA?轉染G1/S?CCPM細胞，孵育24小時后加入BrdU。（B）50?nm?PLK?siRNA轉染G2/M?CCPM細胞并孵育48小時。（C）對于所有使用的siRNA，通過檢測DNA的粒度來檢測細胞凋亡。
參考文獻
1.?Kumar,?R.?Conklin?DS,?Mittal?V.?High-throughput?selection?of?effective?RNAi?probes?for
gene?silencing.?Genome?Res.?13?(10),?2333–2340?(2003).
2.?Luo,?B.?et?al.?Small?interfering?RNA?production?by?enzymatic?engineering?of?DNA
(SPEED).?Proc.?Natl.?Acad.?Sci.?USA?101?(15),?5494–5499?(2004).
3.?Berns,?K.?et?al.?A?large-scale?RNAi?screen?in?human?cells?identifies?new?components?of
the?p53?pathway.?Nature?428?(6981),?431–437?(2004).
4.?Paddison,?P.J.?et?al.?A?resource?for?large-scale?RNA-interference-based?screens?in
mammals.?Nature?428?(6981),?427–431?(2004).
5.?Mousses,?S.?et?al.?RNAi?microarray?analysis?in?cultured?mammalian?cells.?Genome
Res.?13?(10),?2341–2347?(2003).
6.?Ramm,?P.?and?Thomas,?N.?Image-based?screening?of?signal?transduction?assays.
Sci.?STKE.?(177),?(2003).
7.?Price,?J.H.?et?al.?Advances?in?molecular?labeling,?high-throughput?imaging?and?machine?intelligence?portend?powerful?functional?cellular?biochemistry?tools.
J.?Cell.?Biochem.?Suppl.?39,194–210?(2002).
8.?Thomas,?N.?Lighting?the?circle?of?life:?fluorescent?sensors?for?covert?surveillance?of?the
cell?cycle.?Cell?Cycle?2?(6),?545–549?(2003).
9.?Thomas,?N.?et?al.?Characterization?and?gene?expression?profiling?of?a?stable?cell?line
expressing?a?cell?cycle?GFP?sensor.?Cell?Cycle?4?(1),?191–195?(2005).
10.?Gu,?J.?et?al.?Cell?cycle-dependent?regulation?of?a?human?DNA?helicase?that?localizes
in?DNA?damage?foci.?Mol.?Biol.?Cell.?(7),?3320–3332?(2004).
11.?Liu,?X.?and?Erikson,?R.L.?Polo-like?kinase?(Plk)1?depletion?induces?apoptosis?in?cancer
cells.?Proc.?Natl.?Acad.?Sci.?USA?100?(10),?5789–5794?(2003).
關于 GE?Healthcare 的 IN?Cell?Analyzer
IN?Cell?Analyzer?是運用了當今最先進的模塊化快速自動成像技術的高內涵活細胞分析系統，其高度靈敏的成像技術使得科學家們能夠輕松地研究細胞變化過程中的真實生物學進程，目前，該技術已經被廣泛應用于基礎研究和藥物發現領域。該系統將高通量的自動顯微鏡技術、在線自動加樣技術和在線細胞培養技術完美整合，是當前功能最強大、應用最廣泛、設計最靈活、操作最簡便的高內涵細胞分析系統。其主打機型IN?Cell?Analyzer?1000?獲得全球權威咨詢機構Frost?&?Sullivan頒發的2007年細胞分析領域?-?技術革新獎。希望獲取更多信息，請訪問http://www.gehealthcare.com/incell。
?