文獻解讀
過繼性細胞療法(Adoptive cell therapy)是通過復雜的離體培養和細胞工程方法獲得過繼性T細胞，在體外進行培養增殖，并特異性識別腫瘤細胞，而后將具有抗腫瘤反應性的細胞大量的擴增后回輸到癌癥患者體內。白細胞介素-2(IL-2)是大多數ACT治療方案的組成部分，不過其半衰期很短，只有幾分鐘，且治療窗口很小，毒性副作用很大，因此過去使用IL-2治療的患者必須住院24小時密切觀察，稍有不慎就有生命危險。因此，巨大的副作用限制了其在臨床的廣泛應用。
NKTR-214為何方神圣？
為了克服IL-2副作用的難題，嘗試利用IL-2途徑的有益作用，同時限制其毒性，以提高治療潛力，科學家們想盡了各種辦法。最終在正常的IL-2分子上面加上了6個聚乙二醇(PEG)進行修飾，形成暫時沒有活性的藥物，但是在患者中注射了NKTR-214后，加上的6個PEG會逐漸脫落，形成了有活性的2-PEG和1-PEG的形式。其作用機制主要假說：NKTR-214可以比IL-2更好地增強T細胞的擴增能力、激活T細胞能力以及延長T細胞發揮作用的持久力來增強T細胞的抗腫瘤作用。
研究思路
為驗證這一假說，加州大學Parisi等研究者們從基因組和蛋白組等多方面著手，對NKTR-214+ACT vs IL-2+ACT兩種處理進行了研究對比，揭示NKTR-214抗腫瘤效應的作用機制。
在小鼠黑色素瘤模型中，通過腫瘤消退情況，比較兩種處理不同的抗腫瘤效應；
在小鼠黑色素瘤模型中，比較兩種處理對CD8 T細胞增殖能力的影響；
RNA-seq在基因組層面揭示免疫相關基因的表達變化；
IsoLight單細胞功能蛋白組學技術在蛋白組層面揭示免疫細胞多功能性的變化。
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相關結論
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NKTR-214+ACT具有更好的抗腫瘤效應
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Parisi等借助小鼠黑色素瘤模型，分別采取IL-2+ACT和NKTR-214+ACT兩種處理方式，比較腫瘤隨時間的消退情況(Fig.1b)以及腫瘤生長延遲情況(Fig.1c)。經過NKTR-214+ACT處理的小鼠，其腫瘤平均體積相同時間內明顯小于IL-2+ACT處理組；同時也進行了腫瘤延遲生長研究，即進行ACT兩種處理后，單純ACT處理組11天腫瘤組織即生長到1000mm3，IL-2+ACT處理組19.5天后腫瘤組織即生長到1000mm3，而NKTR-214+ACT處理組42天后腫瘤體積才達到1000mm3，由此可見NKTR-214能顯著增強T細胞的抗腫瘤效應，縮短腫瘤消退時間。
Figure 1a. pmel-1 ACT模型的示意圖，分別進行IL-2+ACT和NKTR-214+ACT兩種處理方式。
Figure 2b.腫瘤平均體積隨時間的變化。
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Figure 2c.腫瘤生長延遲曲線（生長到1000mm3）。
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NKTR-214大大提高T細胞的擴增能力
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為了更好地了解ACT + NKTR-214治療提高抗腫瘤活性和T細胞運輸的機制，Parisi等對pmel-1 T細胞進行基因修飾，使其表達熒光素酶，進而使用生物發光成像(BLI)在小鼠體內檢測T細胞富集情況，以跟蹤過繼轉移T細胞的增殖情況和生物分布，每9天是一個治療周期，輸注1次NKTR-214或IL-2刺激T細胞反應，共進行了3個循環周期。
Figure 2a. ACT+IL-2 和ACT+NKTR-214分別處理5天和14天后，T細胞增殖及分布情況。
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Figure 2b. 脾臟體積隨時間依賴性曲線 。
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Figure 2c. 腫瘤生長延遲曲線（生長到1000mm3）。
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NKTR-214處理組脾臟內T細胞在5-7天內顯著擴增(2a)，5天時T細胞數量達到頂峰，其熒光強度是IL-2處理組的14倍(2b)，同時也檢測了浸潤到腫瘤中的T細胞情況(2c)。 NKTR-214治療增加了脾臟T細胞的擴張和持久的腫瘤浸潤性。
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NKTR-214上調免疫相關基因的表達
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為了確定NKTR-214+ACT對腫瘤微環境的影響，Parisi等對第12天采集的腫瘤樣本進行了RNA測序(RNA-seq)分析。與IL-2+ACT組相比，NKTR-214組明顯上調了干擾素、白介素和趨化因子及其受體基因的相關表達，包括IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-15、IL-18和IL-27及相關趨化因子。
Figure 3.RNA-seq：干擾素、白細胞介素及其受體和趨化因子及其受體的基因表達熱圖。
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NKTR-214增強腫瘤特異性T細胞的多功能性
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為了評估IL-2和NKTR-214小鼠黑色素瘤治療組中T細胞功能性差異，研究者借助IsoLight單細胞功能蛋白組檢測平臺，在單細胞水平上分析數千個T細胞，以獲得28種細胞因子的分泌頻率和強度。
Figure 4a. 單細胞功能蛋白分析IsoCode芯片示意圖。
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Figure 4b. 單細胞T細胞多功能性PSI及熱圖。
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與IL-2治療組相比，不論在小鼠脾臟還是腫瘤組織中，NKTR-214組T細胞的多功能性(Polyfunctionality)都大大提升，分別是IL-2組的1.7倍/10倍(Fig.4b)；NKTR-214組脾臟中T細胞多功能指數(PSI)比IL-2組的高達20倍(Fig 4b)，且其多功能性的提升主要依賴于MIP-1α，Granzyme B，IFN-γ的驅動。尤其是在脾臟T細胞中，主要通過提高MIP-1α，IFN-γ，其次Granzyme B，RANTES因子驅動，以及降低腫瘤T細胞中的免疫抑制蛋白TGF-β來實現T細胞多功能性效應。(Fig 4d 4e)
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Figure 4c: 單細胞多功能貢獻指數：顯示個體細胞因子驅動。
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Figure 4d: 細胞因子分泌圖：揭示單個細胞分泌每個細胞因子的頻率。
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Figure 4e: 細胞因子信號分布圖：顯示各細胞因子的單細胞分泌強度。
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盡管NKTR-214在動物模型中顯示出了很好的結果，仍需要在臨床中進行評估，以評估在人類體內的潛在效應。隨后，研究者在臨床I期實驗(NCT02869295)中，輸注治療前后分別采集患者外周血，使用IsoLight單細胞多功能蛋白系統探討了NKTR-214治療機制，發現其同樣可增強患者血液中免疫細胞的擴增能力及多功能性，達到比IL-2更好的治療效果。Fig.5可以看到NKTR-214治療顯著提升了患者NK細胞的PSI指數，尤其是在第二次給藥后，并且在各多功能細胞亞群中，效應因子和刺激因子均占主導地位，尤其是在CD4和CD8 T細胞中，對多功能指數PSI貢獻最大的驅動因素是TNF-α，IFN-γ和IL-5。
Figure 5. NKTR-214治療的患者PBMC中T細胞和NK細胞多功能性指數。
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總結
★ NKTR-214+ACT能夠控制大的、免疫原性差的腫瘤的生長，并且與多功能抗腫瘤CD8效應T細胞的高度擴增、腫瘤靶向性和持久性相關。
★ IsoLight單細胞多功能蛋白檢測技術證明了NKTR-214促進T細胞、NK細胞腫瘤抗原特異性多功能性，并且該多功能性與I期臨床體內抗腫瘤活性相關。
★ IsoLight單細胞多功能蛋白檢測平臺揭示了NKTR-214促進免疫細胞多功能性的關鍵驅動因子。
參考資料
Parisi, G., Saco, J.D., Salazar, F.B. et al. Persistence of adoptively transferred T cells with a kinetically engineered IL-2 receptor agonist. Nat Commun 11, 660 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-019-12901-3.
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IsoPlexis致力于提供業內廣受贊譽的精準單細胞分析系統，助力加速對抗癌癥及各種疑難病癥的進程。通過揭示細胞亞群中獨特的免疫生物標志物，推動免疫療法及靶向治療邁向更精準、個性化的發展階段。
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