本期，我們將圍繞緩沖鹽這一主題，結(jié)合相關(guān)研究文獻，聊聊冷凍或凍干蛋白制劑中的pH值變化及對應(yīng)緩沖體系選擇的考量。
1.?溶液pH值影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性
溶液pH值是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的決定因素之一。對于凍干蛋白制劑，其制劑中往往在凍干前就已經(jīng)添加好緩沖液，以控制①凍干前溶液②凍干過程中冷凍濃縮溶液和③凍干粉復(fù)溶溶液的pH值。
同樣，需要長時間在冷凍狀態(tài)下儲存的液體蛋白制劑，制劑中通常也會添加緩沖液，以維持冷凍狀態(tài)及解凍后溶液的pH值。
蛋白類制劑中最常用的緩沖體系包括組氨酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、氨丁三醇和琥珀酸鹽等緩沖鹽。
2.?蛋白制劑中緩沖液選擇的幾點考量
蛋白類藥物制劑中緩沖液的選擇通常基于所需的pH范圍、緩沖能力和緩沖液特異性催化的可能性。理想情況下，在pH值±1單位酸解常數(shù)(pKa)時使用緩沖液，pH = pKa時緩沖能力最高。例如，當所需pH為~7.0時，廣泛使用磷酸鹽緩沖液(pKa ~ 7.2)，而在pH ~ 6.0時，則選擇組氨酸(pKa ~ 6.1)作為緩沖液。對于具有多個pKa的緩沖液，如磷酸鈉緩沖液(pKas ~ 2.1、7.2和12.3)，有效范圍被擴大。
3、冷凍過程中緩沖鹽結(jié)晶導(dǎo)致pH變化
對于凍干和冷凍制劑處方，在冷凍濃縮過程中緩沖成分的結(jié)晶傾向成為一個重要的考慮因素，在冷凍過程中緩沖成分的選擇性結(jié)晶可能導(dǎo)致pH值的變化，從而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。磷酸鹽緩沖液是一種被廣泛研究的例子，其中十二水磷酸二鈉（磷酸鹽緩沖液的基本成分）在冷凍過程中降低了冷凍濃縮液的pH值，并可能改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
緩沖液的結(jié)晶行為和凍結(jié)過程中相關(guān)的pH值變化取決于幾個因素，包括緩沖液的類型和濃度、初始溶液pH和其他配方成分的濃度。
下圖顯示了不同緩沖液在凍結(jié)時的pH值變化，按初始pH值的遞增順序(從左到右)繪制。左圖為緩沖液pH偏移＞1單位，右圖為緩沖液pH偏移≤1單位。填充的圓圈表示每種緩沖溶液在室溫25℃時的初始pH值。箭頭指向凍結(jié)過程中pH值變化的方向，箭頭的尖端表示將溶液凍結(jié)至-25℃后的最終pH值。
從圖中可以觀察到不同因素對緩沖液凍結(jié)過程中pH值變化的影響。
（1）初始pH值：檸檬酸鹽緩沖液對初始pH為5.0或6.0的溶液效果良好，但當初始pH為4.0時，pH值會發(fā)生~+2個單位的變化（淺橘紅色，左圖第一個柱子及右圖兩個同色柱子）。同樣，組氨酸緩沖液在pH為5.5時顯示+2個單位的pH位移，而在pH為6.0和7.0時則沒有（深綠色，左圖第四個柱子及右圖兩個同色柱子）。
（2）緩沖液濃度：緩沖液的濃度對pH值變化的幅度和性質(zhì)都有顯著的影響。例如，初始pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，濃度為100 mM時，最終凍結(jié)后pH值為2.8，濃度為10 mM時，最終凍結(jié)后pH值為4.1（左圖最右側(cè)兩個柱子）。
（3）與其他溶質(zhì)的相互作用：制劑處方中的其他溶質(zhì)和緩沖液組分的相互作用可能會影響彼此的結(jié)晶傾向。了解共溶質(zhì)對緩沖液結(jié)晶的影響是很重要的，因為這將影響冷凍濃縮液的pH，從而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
例如，當含有磷酸鹽緩沖液(10或100 mM)和甘氨酸(0.8% w/v)的溶液被冷凍時，這兩種組分都更易結(jié)晶。雖然這并不影響甘氨酸作為凍干賦形劑的功能，但緩沖鹽的明顯結(jié)晶導(dǎo)致凍結(jié)時pH值發(fā)生變化。
有趣的是，0.8% w/v濃度甘氨酸的存在增加了10mM和100mM磷酸鹽緩沖液在冷凍時的pH值變化幅度。而在低濃度(0.4% w/v)下，甘氨酸反而會抑制磷酸鹽緩沖液在冷凍時的pH值變化。然而，在如此低的濃度下，甘氨酸可能無法發(fā)揮凍干賦形劑的作用。因此，需要明智地選擇配方成分及其濃度，以確保各個組分的功能，從而獲得穩(wěn)定的凍干制劑處方。
同樣，磷酸鹽緩沖液也能抑制甘露醇結(jié)晶。下圖展示了緩沖液濃度對甘露醇和甘氨酸在最終冷凍產(chǎn)品中結(jié)晶情況的影響，溶液中甘露醇和甘氨酸含量為5% w/w。當甘露醇和甘氨酸混合使用時，磷酸鹽緩沖鹽在冷凍溶液中顯著抑制這兩種溶質(zhì)的結(jié)晶，磷酸鹽緩沖液濃度的增加（50mM~200mM）降低了甘露醇和甘氨酸的結(jié)晶度。
甘露醇和甘氨酸的結(jié)晶度降低，可以轉(zhuǎn)化為更高的蛋白酶活性保留。下圖為冷凍干燥后輔料結(jié)晶對乳酸脫氫酶（LDH）活性的影響。上半部分為蛋白酶活性與緩沖液濃度的關(guān)系（配方中甘露醇和甘氨酸各占5% w/w），可見隨著緩沖液濃度升高，凍干后保留的蛋白酶活性升高。下半部分為最終產(chǎn)品中的結(jié)晶甘露醇和甘氨酸餾分。隨著緩沖液濃度升高，凍干產(chǎn)物中甘露醇和甘氨酸的結(jié)晶度降低。
一般來說，只有無定形的溶質(zhì)才能抑制緩沖液的結(jié)晶。然而，當共溶質(zhì)結(jié)晶時，也觀察到緩沖結(jié)晶。
4、應(yīng)對思路
基于上述影響因素分析，在進行制劑處方中緩沖體系的篩選時，明智的做法是使用最低有效濃度的緩沖液。另一種方法是通過配方成分抑制緩沖液結(jié)晶，從而減弱任何pH值的變化。非結(jié)晶性溶質(zhì)如海藻糖，蔗糖可抑制緩沖結(jié)晶。有時，蛋白質(zhì)本身可能會抑制緩沖液結(jié)晶，從而阻止pH值的變化。
5、小結(jié)?
本文主要圍繞凍干/冷凍狀態(tài)下緩沖液pH改變對蛋白類制劑（抗體，抗體偶聯(lián)藥物等）穩(wěn)定性的影響，考慮到緩沖鹽結(jié)晶導(dǎo)致pH值變化主要與其自身性質(zhì)有關(guān)，與活性成分關(guān)系不大，因此相關(guān)考量適用于絕大多數(shù)pH敏感型的生物制劑，如核酸藥物（mRNA-LNP），病毒載體制劑（AAV）等。例如，輝瑞新冠mRNA疫苗上市后制劑處方中緩沖體系由PBS變更為Tris/Tris-HCl，就很可能與磷酸鹽緩沖液在極低溫度下發(fā)生pH值偏移有關(guān)。
下一期，艾偉拓產(chǎn)品團隊將圍繞磷酸鹽緩沖液(PBS)在冷凍或凍干狀態(tài)下pH的變化及應(yīng)對策略做進一步分析，敬請期待！
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