本期，我們將圍繞緩沖鹽這一主題，結合相關研究文獻，聊聊冷凍或凍干蛋白制劑中的pH值變化及對應緩沖體系選擇的考量。
1.?溶液pH值影響蛋白質穩定性
溶液pH值是蛋白質穩定性的決定因素之一。對于凍干蛋白制劑，其制劑中往往在凍干前就已經添加好緩沖液，以控制①凍干前溶液②凍干過程中冷凍濃縮溶液和③凍干粉復溶溶液的pH值。
同樣，需要長時間在冷凍狀態下儲存的液體蛋白制劑，制劑中通常也會添加緩沖液，以維持冷凍狀態及解凍后溶液的pH值。
蛋白類制劑中最常用的緩沖體系包括組氨酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、氨丁三醇和琥珀酸鹽等緩沖鹽。
2.?蛋白制劑中緩沖液選擇的幾點考量
蛋白類藥物制劑中緩沖液的選擇通?；谒璧膒H范圍、緩沖能力和緩沖液特異性催化的可能性。理想情況下，在pH值±1單位酸解常數(pKa)時使用緩沖液，pH = pKa時緩沖能力最高。例如，當所需pH為~7.0時，廣泛使用磷酸鹽緩沖液(pKa ~ 7.2)，而在pH ~ 6.0時，則選擇組氨酸(pKa ~ 6.1)作為緩沖液。對于具有多個pKa的緩沖液，如磷酸鈉緩沖液(pKas ~ 2.1、7.2和12.3)，有效范圍被擴大。
3、冷凍過程中緩沖鹽結晶導致pH變化
對于凍干和冷凍制劑處方，在冷凍濃縮過程中緩沖成分的結晶傾向成為一個重要的考慮因素，在冷凍過程中緩沖成分的選擇性結晶可能導致pH值的變化，從而影響蛋白質的穩定性。磷酸鹽緩沖液是一種被廣泛研究的例子，其中十二水磷酸二鈉（磷酸鹽緩沖液的基本成分）在冷凍過程中降低了冷凍濃縮液的pH值，并可能改變蛋白質的穩定性。
緩沖液的結晶行為和凍結過程中相關的pH值變化取決于幾個因素，包括緩沖液的類型和濃度、初始溶液pH和其他配方成分的濃度。
下圖顯示了不同緩沖液在凍結時的pH值變化，按初始pH值的遞增順序(從左到右)繪制。左圖為緩沖液pH偏移＞1單位，右圖為緩沖液pH偏移≤1單位。填充的圓圈表示每種緩沖溶液在室溫25℃時的初始pH值。箭頭指向凍結過程中pH值變化的方向，箭頭的尖端表示將溶液凍結至-25℃后的最終pH值。
從圖中可以觀察到不同因素對緩沖液凍結過程中pH值變化的影響。
（1）初始pH值：檸檬酸鹽緩沖液對初始pH為5.0或6.0的溶液效果良好，但當初始pH為4.0時，pH值會發生~+2個單位的變化（淺橘紅色，左圖第一個柱子及右圖兩個同色柱子）。同樣，組氨酸緩沖液在pH為5.5時顯示+2個單位的pH位移，而在pH為6.0和7.0時則沒有（深綠色，左圖第四個柱子及右圖兩個同色柱子）。
（2）緩沖液濃度：緩沖液的濃度對pH值變化的幅度和性質都有顯著的影響。例如，初始pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，濃度為100 mM時，最終凍結后pH值為2.8，濃度為10 mM時，最終凍結后pH值為4.1（左圖最右側兩個柱子）。
（3）與其他溶質的相互作用：制劑處方中的其他溶質和緩沖液組分的相互作用可能會影響彼此的結晶傾向。了解共溶質對緩沖液結晶的影響是很重要的，因為這將影響冷凍濃縮液的pH，從而影響蛋白質的穩定性。
例如，當含有磷酸鹽緩沖液(10或100 mM)和甘氨酸(0.8% w/v)的溶液被冷凍時，這兩種組分都更易結晶。雖然這并不影響甘氨酸作為凍干賦形劑的功能，但緩沖鹽的明顯結晶導致凍結時pH值發生變化。
有趣的是，0.8% w/v濃度甘氨酸的存在增加了10mM和100mM磷酸鹽緩沖液在冷凍時的pH值變化幅度。而在低濃度(0.4% w/v)下，甘氨酸反而會抑制磷酸鹽緩沖液在冷凍時的pH值變化。然而，在如此低的濃度下，甘氨酸可能無法發揮凍干賦形劑的作用。因此，需要明智地選擇配方成分及其濃度，以確保各個組分的功能，從而獲得穩定的凍干制劑處方。
同樣，磷酸鹽緩沖液也能抑制甘露醇結晶。下圖展示了緩沖液濃度對甘露醇和甘氨酸在最終冷凍產品中結晶情況的影響，溶液中甘露醇和甘氨酸含量為5% w/w。當甘露醇和甘氨酸混合使用時，磷酸鹽緩沖鹽在冷凍溶液中顯著抑制這兩種溶質的結晶，磷酸鹽緩沖液濃度的增加（50mM~200mM）降低了甘露醇和甘氨酸的結晶度。
甘露醇和甘氨酸的結晶度降低，可以轉化為更高的蛋白酶活性保留。下圖為冷凍干燥后輔料結晶對乳酸脫氫酶（LDH）活性的影響。上半部分為蛋白酶活性與緩沖液濃度的關系（配方中甘露醇和甘氨酸各占5% w/w），可見隨著緩沖液濃度升高，凍干后保留的蛋白酶活性升高。下半部分為最終產品中的結晶甘露醇和甘氨酸餾分。隨著緩沖液濃度升高，凍干產物中甘露醇和甘氨酸的結晶度降低。
一般來說，只有無定形的溶質才能抑制緩沖液的結晶。然而，當共溶質結晶時，也觀察到緩沖結晶。
4、應對思路
基于上述影響因素分析，在進行制劑處方中緩沖體系的篩選時，明智的做法是使用最低有效濃度的緩沖液。另一種方法是通過配方成分抑制緩沖液結晶，從而減弱任何pH值的變化。非結晶性溶質如海藻糖，蔗糖可抑制緩沖結晶。有時，蛋白質本身可能會抑制緩沖液結晶，從而阻止pH值的變化。
5、小結?
本文主要圍繞凍干/冷凍狀態下緩沖液pH改變對蛋白類制劑（抗體，抗體偶聯藥物等）穩定性的影響，考慮到緩沖鹽結晶導致pH值變化主要與其自身性質有關，與活性成分關系不大，因此相關考量適用于絕大多數pH敏感型的生物制劑，如核酸藥物（mRNA-LNP），病毒載體制劑（AAV）等。例如，輝瑞新冠mRNA疫苗上市后制劑處方中緩沖體系由PBS變更為Tris/Tris-HCl，就很可能與磷酸鹽緩沖液在極低溫度下發生pH值偏移有關。
下一期，艾偉拓產品團隊將圍繞磷酸鹽緩沖液(PBS)在冷凍或凍干狀態下pH的變化及應對策略做進一步分析，敬請期待！
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