之前我們揭秘了 3 種抗體驗證策略——二元策略、范圍策略、正交策略，下面繼續跟隨小編學習 CST 完整的抗體驗證系統。教你挑選值得信賴的抗體！
CST 抗體驗證第 4 個策略——多種抗體策略。
多種抗體策略是一種強大的抗體驗證方法。實現此目標的最常見方法之一是使用一種抗體進行靶標的免疫沉淀 (IP)，然后通過用另一種針對相同靶標的抗體進行蛋白質印跡分析檢測。這能確定兩種抗體結合正確的生物分子。
多種抗體驗證的另一種熟悉方法涉及使用針對同一靶標上不同、不重疊表位的兩種或多種抗體，以產生直接可比的免疫染色數據。這通常通過蛋白質印跡，免疫細胞化學或免疫組織化學等技術來證明。通過平行地用多種抗體檢測相同的樣品，可以相對快速直觀地了解抗體特異性。
在沒有兩種針對同一靶標的抗體的情況下，可以采用其他策略來確定抗體特異性。例如，免疫沉淀聯合隨后的質譜分析方法越來越多地用于檢測經過評估中抗體富集的蛋白。
跟采用抗體驗證標志的其他任何一種一樣，多種抗體策略絕不應成為確定抗體特異性的唯.一策略。例如，免疫組織化學檢測的抗體結果可比，但實際上兩種試劑均識別相同的不正確、非靶標生物分子，為消除這種可能性，應始終通過其他抗體驗證策略來支持多種抗體檢測數據。此外，不應以“盲法”方式使用多種抗體方法作為篩選或選擇抗體的手段；所有經這種方法檢測的抗體都應使用"抗體驗證系列"中概述的其他策略獨立驗證。
多種抗體策略具體方法如下：
免疫沉淀
免疫沉淀是多種抗體驗證最顯而易見的方法之一，明確地直觀顯示兩種不同的抗體結合同一個靶標。如果抗體識別分子的不同區域，則證據最充分，如圖 1 所示。在這里，NeuN (E4M5P) 小鼠單克隆抗體已用于免疫沉淀大鼠腦提取物的 NeuN 蛋白，NeuN (D4G4O) Rabbit mAb 已用于蛋白質印跡分析。圖 2 顯示了類似的數據集，其中 TAZ (EBE9G) Rabbit mAb 用于免疫沉淀，第二種 TAZ (D316D) Rabbit mAb 用于免疫印跡。在這兩種情況下，加入同種型對照均有助于確認抗體的特異性。
Figure 1
對大鼠腦組織提取物的 NeuN 蛋白進行免疫沉淀。泳道 1 為 10% input，泳道 2 為 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656，泳道 3 為 NeuN (E4M5P)。使用 NeuN (D4G4O) 進行蛋白質印跡分析。
Figure 2
對 HeLa 細胞提取物的 TAZ 蛋白進行的免疫沉淀。泳道 1 為 10% input，泳道 2 為 Rabbit (DA1E) Isotype Control，泳道 3 為 TAZ (E8E9G)。使用 TAZ (D3I6D) Rabbit mAb #70148 進行蛋白印跡分析。
不同抗原檢測
通過免疫染色技術使用多種抗體檢測相同樣本是確認抗體特異性的簡單但未充分利用的方法。如果兩種或多種不同的抗體試劑顯示出相同的染色模式或抗原定位，則可以確信抗體正在特異性地對靶標進行染色。
可以使用先前驗證的抗體來確認從正在驗證的抗體中觀察到的免疫染色數據。如果采用測試抗體獲得的結果可重現經過驗證的抗體的結果，則這被視為特異性的指標。例如，圖 3顯示了采用可識別人蛋白質上不同表位的兩種 Helios 兔單克隆抗體進行的兩種不同組織類型的免疫組織化學分析。兩種組織中的染色模式相當，表明兩種抗體都對靶標具有特異性。在圖 4 中，使用兩種不同的 MAGE-A4 兔單克隆抗體對人鱗狀細胞肺癌組織染色。再次，兩種抗體都可以看見類似染色，為它們的特異性提供可信度。
除了提供可識別同一靶標上不同表位的兩種抗體的平行數據外，理想的情況是在多種產品中查找可比數據。例如，圖 5 和 6 顯示與兩種不同的抗 CD200 抗體相關的蛋白質印跡數據相似，突顯了用于檢測抗體的模型一致性和產生結果的相似性。相反，如果針對同一靶標的兩種不同產品的數據差異很大，則結果的有效性可能會受到質疑。
Figure 3
使用 Helios (E4L5U)（上圖）或 Helios 抗體（下圖）對石蠟包埋的人 B 細胞非霍奇金氏淋巴瘤（左圖）或前列腺癌（右圖）細胞進行免疫組織化學分析。這兩種抗體可檢測人 Helios 上的獨立、獨特表位。使用兩種抗體獲得的相似染色模式有助于確認染色特異性。
Figure 4
使用 MAGE-A4 (E7O1U)（上圖）或 MAGE-A4 Antibody（下圖）對石蠟包埋的人鱗狀細胞肺癌進行免疫組織化學分析。這兩種抗體可檢測人 MAGE-A4 上的獨立、獨特表位。使用兩種抗體獲得的相似染色模式有助于確認染色特異性。
Figure 5
使用 CD200 (E5I9V)（上圖）或 β-Actin (D6A8)（下圖）對不同細胞系的提取物進行蛋白質印跡分析。
Figure 6
使用 CD200 (E2K4C)（上圖）和 β-Actin (D6A8)（下圖）對不同細胞系的提取物進行蛋白質印跡分析。
染色質免疫沉淀
也可使用多種抗體驗證染色質免疫沉淀 (ChIP) 實驗結果。ChIP 用于識別與體內特定染色質片段結合的蛋白質，例如轉錄因子和輔助因子，可用于探測細胞天然染色質環境中的蛋白質-DNA 相互作用。通過使用針對同一靶蛋白的非重疊表位的多種抗體，或針對同一 DNA 結合復合物中不同靶蛋白的多種抗體，并且將 ChIP 與 qPCR 或 NG-seq 聯合分析，研究人員就能從一種用途廣泛的抗體交叉驗證方法中受益。
圖 7 顯示了使用針對 SW1/SNF 復合物中三種不同蛋白質靶標的三種抗體 SMARCC1、SMARCB1 和 SS18 進行實驗所得的 ChIP 數據。經過 ChIP 和隨后的 NG-seq 分析，可以看出所有三種抗體均產生非常相似的結果。
Figure 7
使用 SimpleChIP? Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 對在無酚紅的培養基和 5% 活性炭剝離的 FBS 中生長 4 天，隨后使用 β-雌二醇（10 nM，45 分鐘）處理的 MCF7 細胞的交聯染色質與 SMARCC1/BAF155 (D7F8S)、SMARCB1/BAF47 (D8M1X) 或 SS18 (D6I4Z) 進行染色質免疫沉淀。使用 SimpleChIP? ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina? 制備 DNA 庫。SMARCC1/BAF155、SMARCB1/BAF47 和 SS18 均為 SWI/SNF 復合體的所有亞基。結果圖顯示了三個亞基與 pS2/TFF1 基因結合，pS2/TFF1 是一種已知的 SWI/SNF 靶標基因。
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