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題目：

Identification and initial functional characterization of lysosomal integral?membrane protein type 2 (LIMP-2) in turbot (Scophthalmus maximus L.)

期刊：Developmental & Comparative Immunology

影響因子：3.119

PMID：31176756

作者單位：青島農業大學

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1.大菱鲆LIMP2基因的鑒定

分子克隆后，獲得一個具有1593bp開放閱讀框（ORF）的SmLIMP2基因（GenBank登錄號：MH748107）。ORF編碼530個氨基酸殘基，預測分子質量為59.95kDa，理論等電點為6.44。推測得到的SmLIMP2蛋白具有9個蛋白激酶C磷酸化位點、11個酪蛋白激酶II磷酸化位點和10個N-糖基化位點。此外，推測得到的SmLIMP2蛋白有55個帶負電的殘基（Asp+Glu），52個帶正電的殘基（Arg+Lys），不穩定性指數為37.18，脂肪族指數為87.49。與其它物種相比，SmLIMP2基因與褐牙鲆的相似性最高，為97.0%，其次是大黃魚94.9%，虹鱒94.5%，而與褐牙鲆的同源性最高，為92.5%，其次是大黃魚89.6%，半滑舌鰨94.5%。

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2.SmLIMP2基因的基因組結構分析

作者利用大菱鲆基因組數據庫研究了SmLIMP2的基因組結構，并與已發表的LIMP2基因對比了外顯子/內含子結構。作者發現有趣的是，在人、鼠和雞中的LIMP2有12個外顯子，而硬骨魚類有13個外顯子。而且，人和小鼠的12個外顯子完全相同，而雞中只有兩個外顯子是與人和鼠是不同的。此外，在硬骨魚類含有的13個外顯子中，大菱鲆和斑馬魚只有1個外顯子不同，大菱鲆和鯰魚只有2個外顯子不同，斑馬魚和鯰魚只有1個外顯子不同。

Figure 1

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3.系統進化樹分析

作者利用MEGA 6對不同物種LIMP2的氨基酸序列進行了系統進化樹分析。結果顯示，SmLIMP2首先與褐牙鲆聚集，然后依次與大黃魚、半滑舌鰨、虹鱒聚集。另一個進化枝由鯉魚（C. carpio）、斑馬魚（D. rerio）和斑點叉尾鮰（I. punctatus）組成。其他較高等的脊椎動物形成了單個進化分支，包括人（H. sapiens）、小鼠（M. musculus）、雞（G.gallus）和熱帶爪蟾（X. tropicalis）。

Figure 2

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4.SmLIMP2基因的共線性分析

?通過共線性分析進一步驗證了SmLIMP2的鑒定。結果顯示，從哺乳動物到脊椎動物的物種中都觀察到了LIMP2的相同相鄰基因。其中在大菱鲆、鯰魚、雞、小鼠和人中觀察到SmLIMP2的鄰近基因都包含158個螺旋結構域（CCDC158）、序列相似家族47成員E（FAM47E）和具有EF-hand結構域2的蛋白磷酸酶（PPEF2）。然而，N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（NAAA）只在鯰魚、雞、小鼠和人中觀察到。

Figure 3

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5.SmLIMP2的組織分布

作者采用Real-time PCR的方法，研究了SmLIMP2在大菱鲆皮膚、鰓、腸、血、肝、脾、頭腎、腦等8種健康組織中的組織分布規律。結果顯示，SmLIMP2在所有被檢測的組織中廣泛表達，其中，在腦中表達水平最高（26.44倍），其次是腸（9.93倍）和皮膚（6.03倍），而在肝臟中表達水平最低（對照）。

Figure 4

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6.細菌攻擊后SmLIMP2的表達譜

為了研究SmLIMP2在大菱鲆粘膜組織中的免疫作用，作者用革蘭氏陽性菌S.iniae和革蘭氏陰性菌V.anguillarum浸泡攻擊大菱鲆后，檢測了SmLIMP2在大菱鲆粘膜組織（鰓、皮膚和腸）中的表達譜。

在感染S.iniae后，SmLIMP2只在鰓中上調，在皮膚和腸中下調，具體表現為：在腮中，4h快速上升6.97倍，8h快速上升4.06倍，12h迅速恢復到基礎水平；在腸中，2h下降幅度最大，達0.17倍，其余時間點迅速恢復到基礎水平。在皮膚中，SmLIMP2在2小時下調0.37倍，8小時下調0.68倍。

在V.anguillarum感染后，三種組織中SmLIMP2的表達情況均上調。具體表現為：在腮中，在2小時時檢測到最高的上調，上調幅度為7.52倍。在皮膚中，在2小時時上調4.68倍，在12h時上調4.34倍。

Figure 5

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Figure 6

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7.微生物配體的體外結合

在表達譜分析之后，作者又研究了SmLIMP2與微生物配體的結合能力。rSmLIMP2是從大腸桿菌中純化出來的一種天然His標記蛋白，并且只有SmLIMP2的胞外區被誘導，在western blot分析中，只觀察到一條分子量為50kDa的帶。最后，研究了SmLIMP2與微生物配體和虹彩病毒（iridovirus）的結合能力，具體表現為：對照蛋白與被測配體沒有任何結合能力，而rSmLIMP2對LPS的結合能力最強，其次是iridovirus、PGN和LT。PGN和LTA均在4μg/ml時達到峰值，而LPS和iridovirus均在8μg/ml時達到峰值。

Figure 7

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Figure 8

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8.凝集試驗

作者用凝集試驗進一步鑒定LIMP2的免疫功能。在含鈣的TBS緩沖液中的凝集試驗表明，rSmLIMP2能夠引起大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌強烈的凝集，其中，大腸桿菌和鰻弧菌的凝集作用更強。