干貨來襲!免疫熒光雙重染色實驗指南-產品資訊-資訊-生物在線

干貨來襲!免疫熒光雙重染色實驗指南

作者:北京索萊寶科技有限公司 2021-07-02T11:36 (訪問量:30004)

免疫熒光技術(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術,簡稱IF,是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一種蛋白示蹤技術。怎么才能得到別人那樣顏色明亮多彩又好看精準的圖片呢?讓我們先來了解什么是免疫熒光雙重染色吧!免疫熒光雙重染色是使用攜帶有不同顏色熒光標記物的抗體對同一樣本中的兩種不同抗原進行區分和定位,也稱免疫共染色。通常情況下,同時檢測組織或細胞樣本中的兩個或多個抗原時,需要進行雙重甚至多重染色。利用熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡可看見熒光所在的細胞或組織,進而確定抗原的性質和定位。

基本原理

根據抗原抗體特異性結合的反應原理,用已結合示蹤熒光標記物(通常是熒光標記物或者熒光蛋白)的抗體直接或間接識別抗原,示蹤物質顯色的地方即是抗原的所在區域。

雙重染色類型

依據與抗原直接結合的抗體(通常稱之為一抗)是否帶有熒光標記物可將實驗分為直接法和間接法。

直接法

使用熒光標記物標記的一抗,直接與抗原反應。

優點:特異性強、實驗簡便快速;

缺點:抗體用量較大、靈敏度較低。

間接法

用未標記的一抗與抗原樣本反應,然后孵育用于結合一抗的熒光標記物標記的二抗,形成抗原-一抗-二抗復合物。

優點:靈敏度高、節省抗體;

缺點:存在非特異性染色。

基本實驗步驟


結果展示


圖2 間接法免疫熒光雙染結果

紅色熒光-K107573P

綠色熒光-K200059M

注意事項

(1)每次實驗均需設置陽性對照、陰性對照和熒光標記物對照;

(2)直接法雙重染色要求一抗的熒光標記物激發波段不同,而間接法雙重染色要求一抗不同種屬以及二抗攜帶的熒光標記物激發波段不同;

(3)雙染前,要對每個抗體進行單獨染色,確定合適染色條件和抗體定位;

(4)注意組織切片或細胞爬片全程保持濕潤;

(5)抗體孵育后,用PBS或其他洗滌液充分洗滌組織切片,去除多余抗體;

(6)對于背景較高的組織樣本,做組織封閉后效果更好。


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