干貨來襲！免疫熒光雙重染色實(shí)驗(yàn)指南-產(chǎn)品資訊-資訊-生物在線

免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術(shù)，簡(jiǎn)稱IF，是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一種蛋白示蹤技術(shù)。怎么才能得到別人那樣顏色明亮多彩又好看精準(zhǔn)的圖片呢？讓我們先來了解什么是免疫熒光雙重染色吧！免疫熒光雙重染色是使用攜帶有不同顏色熒光標(biāo)記物的抗體對(duì)同一樣本中的兩種不同抗原進(jìn)行區(qū)分和定位，也稱免疫共染色。通常情況下，同時(shí)檢測(cè)組織或細(xì)胞樣本中的兩個(gè)或多個(gè)抗原時(shí)，需要進(jìn)行雙重甚至多重染色。利用熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡可看見熒光所在的細(xì)胞或組織，進(jìn)而確定抗原的性質(zhì)和定位。

基本原理

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)原理，用已結(jié)合示蹤熒光標(biāo)記物（通常是熒光標(biāo)記物或者熒光蛋白）的抗體直接或間接識(shí)別抗原，示蹤物質(zhì)顯色的地方即是抗原的所在區(qū)域。

雙重染色類型

依據(jù)與抗原直接結(jié)合的抗體（通常稱之為一抗）是否帶有熒光標(biāo)記物可將實(shí)驗(yàn)分為直接法和間接法。

直接法

使用熒光標(biāo)記物標(biāo)記的一抗，直接與抗原反應(yīng)。

優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便快速；

缺點(diǎn)：抗體用量較大、靈敏度較低。

間接法

用未標(biāo)記的一抗與抗原樣本反應(yīng)，然后孵育用于結(jié)合一抗的熒光標(biāo)記物標(biāo)記的二抗，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、節(jié)省抗體；

缺點(diǎn)：存在非特異性染色。

基本實(shí)驗(yàn)步驟

結(jié)果展示

圖2 間接法免疫熒光雙染結(jié)果

紅色熒光-K107573P

綠色熒光-K200059M

注意事項(xiàng)

（1）每次實(shí)驗(yàn)均需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和熒光標(biāo)記物對(duì)照；

（2）直接法雙重染色要求一抗的熒光標(biāo)記物激發(fā)波段不同，而間接法雙重染色要求一抗不同種屬以及二抗攜帶的熒光標(biāo)記物激發(fā)波段不同；

（3）雙染前，要對(duì)每個(gè)抗體進(jìn)行單獨(dú)染色，確定合適染色條件和抗體定位；

（4）注意組織切片或細(xì)胞爬片全程保持濕潤(rùn)；

（5）抗體孵育后，用PBS或其他洗滌液充分洗滌組織切片，去除多余抗體；

（6）對(duì)于背景較高的組織樣本，做組織封閉后效果更好。

北京索萊寶二抗種類（均可加標(biāo)）

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