Western 免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的實(shí)驗(yàn)。在WB 實(shí)驗(yàn)中常會出現(xiàn)各種問題，而拖慢實(shí)驗(yàn)速度，使實(shí)驗(yàn)達(dá)不到理想的效果。今天百螢跟各位同學(xué)一起分享下 WB 實(shí)驗(yàn)中各種問題及問題建議。
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常見問題 |
可能原因 |
建議 |
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電泳條帶成笑臉狀 |
膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統(tǒng)溫度偏高 |
減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳 |
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電泳條帶成皺眉狀 |
可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全 |
調(diào)整裝置 |
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拖尾 |
樣品溶解不好 |
樣品充分溶解混勻后上樣 |
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紋理(縱向條紋) |
樣品中含有不溶性顆粒 |
樣品充分?jǐn)嚢杌靹?/span> |
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條帶偏斜 |
電極不平衡或者加樣位置偏斜 |
調(diào)整電極和加樣 |
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條帶兩邊擴(kuò)散 |
加樣量過多 |
適當(dāng)減少上樣量 |
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Marker 變黑色 |
抗體和 Marker 蛋白反應(yīng) |
在 Marker 和 sample 之間空出一個(gè)孔不上樣 |
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背景高 |
膜封閉不夠 |
延長封閉時(shí)間，選擇適宜的抗體稀釋度 |
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一抗稀釋度不適宜 |
對抗體進(jìn)行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度 |
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一抗孵育的溫度偏高 |
建議 4℃ 結(jié)合過夜 |
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二抗?jié)舛榷冗^高 |
降低二抗?jié)舛?/span> |
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二抗的非特異性背景 |
增加一個(gè)二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否是由于二抗所致。可選擇其它二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對重鏈） |
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二抗孵育時(shí)間過久 |
減少二抗孵育時(shí)間 |
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選擇膜的問題 |
硝酸纖維素的背景會比 PVDF 膜低 |
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膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過 |
實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤 |
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檢測時(shí)曝光時(shí)間過長 |
注意曝光時(shí)間的縮短 |
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洗膜不充分 |
增加洗膜的時(shí)間和次數(shù) |
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抗體和封閉蛋白有交叉反應(yīng) |
檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應(yīng) |
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雜帶較多 |
目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)，乙酰化位點(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶 |
查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白試劑大小 |
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目的蛋白有其他剪切本 |
查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性 |
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樣品處理過程中目的蛋白發(fā)生降解 |
裂解液中加入蛋白酶抑制劑，樣品處理在冰上進(jìn)行 |
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上樣量過高，太敏感 |
適當(dāng)減少上樣量 |
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一抗不純 |
純化抗體 |
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一抗特異性不高 |
重新選擇或制備高特異性的抗體 |
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二抗的非特異性結(jié)合 |
增加一個(gè)二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否是由于二抗所致。可選擇其它二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對重鏈） |
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一抗或二抗?jié)舛绕?/span> |
降低抗體濃度 |
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細(xì)胞傳代較多，導(dǎo)致蛋白變異 |
使用原代或傳代少的細(xì)胞作對照 |
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蛋白條帶位置 （大小）不對 |
二聚體或多聚體存在 |
增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度 |
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翻譯后剪切 |
比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執(zhí)行功能時(shí)需要進(jìn)行剪切成活化的形式 |
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相對電荷 |
氨基酸電荷的組成 |
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蛋白修飾 |
比如糖基化、磷酸化等修飾狀態(tài)會導(dǎo)致蛋白分子量增加 |
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膠濃度 |
不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差 |
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無蛋白條帶 |
抗體孵育不充分 |
增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間 |
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酶失活 |
直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 |
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標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因 |
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試劑之間不匹配 |
一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級檢測系統(tǒng)的有效性 |
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一抗失效 |
選擇在有效期內(nèi)抗體，幷選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液 |
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HRP 抑制劑 |
所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉 |
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抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白 |
購買抗體前應(yīng)認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應(yīng)蛋白 |
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二抗與一抗不匹配 |
選擇針對一抗來源種屬的抗體 |
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蛋白條帶信號弱 |
抗體孵育不充分 |
增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間 |
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酶活性降低 |
直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 |
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洗膜過度 |
洗膜時(shí)間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20 |
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標(biāo)本中靶蛋白含量太低 |
增加樣本上樣量 |
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抗體活性降低 |
選擇有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間放置 |
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蛋白轉(zhuǎn)移不充分 |
可以用麗春紅染膜幷結(jié)合染膠（考馬斯藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)移到膜上或轉(zhuǎn)移過度，適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流 |
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封閉過度 |
減少封閉劑的量或縮短時(shí)間，換用不同封閉劑類型 |
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曝光時(shí)間過短 |
延長曝光時(shí)間 |
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HRP 抑制劑 |
所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉 |
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背景有黑色斑點(diǎn) |
抗體與封閉試劑反應(yīng) |
使用前過濾封閉試劑 |
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HRP 偶聯(lián)二抗中有聚集體 |
過濾二抗試劑，去除聚集體 |
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暗背景上白色帶 |
HRP 含量過高 |
降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
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背景有不均勻的白色斑點(diǎn) |
轉(zhuǎn)膜過程中有氣泡存在 |
仔細(xì)檢測，避免存在氣泡 |
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抗體分布不均勻 |
孵育抗體時(shí)使用搖床 |
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