常見問題

可能原因

建議

電泳條帶成笑臉狀

膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統溫度偏高

減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進行電泳

電泳條帶成皺眉狀

可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全

調整裝置

拖尾

樣品溶解不好

樣品充分溶解混勻后上樣

紋理(縱向條紋)

樣品中含有不溶性顆粒

樣品充分攪拌混勻

條帶偏斜

電極不平衡或者加樣位置偏斜

調整電極和加樣

條帶兩邊擴散

加樣量過多

適當減少上樣量

Marker 變黑色

抗體和 Marker 蛋白反應

在 Marker 和 sample 之間空出一個孔不上樣

背景高

膜封閉不夠

延長封閉時間，選擇適宜的抗體稀釋度

一抗稀釋度不適宜

對抗體進行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度

一抗孵育的溫度偏高

建議 4℃ 結合過夜

二抗濃度度過高

降低二抗濃度

二抗的非特異性背景

增加一個二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強的，只針對重鏈）

二抗孵育時間過久

減少二抗孵育時間

選擇膜的問題

硝酸纖維素的背景會比 PVDF 膜低

膜在實驗過程中干過

實驗過程中要注意保持膜的濕潤

檢測時曝光時間過長

注意曝光時間的縮短

洗膜不充分

增加洗膜的時間和次數

抗體和封閉蛋白有交叉反應

檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應

雜帶較多

目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點，糖基化位點，乙?；稽c等），本身可以呈現多條帶

查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白試劑大小

目的蛋白有其他剪切本

查閱文獻或生物信息學分析可能性

樣品處理過程中目的蛋白發生降解

裂解液中加入蛋白酶抑制劑，樣品處理在冰上進行

上樣量過高，太敏感

適當減少上樣量

一抗不純

純化抗體

一抗特異性不高

重新選擇或制備高特異性的抗體

二抗的非特異性結合

增加一個二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強的，只針對重鏈）

一抗或二抗濃度偏高

降低抗體濃度

細胞傳代較多，導致蛋白變異

使用原代或傳代少的細胞作對照

蛋白條帶位置

（大小）不對

二聚體或多聚體存在

增加蛋白質變性過程及強度

翻譯后剪切

比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執行功能時需要進行剪切成活化的形式

相對電荷

氨基酸電荷的組成

蛋白修飾

比如糖基化、磷酸化等修飾狀態會導致蛋白分子量增加

膠濃度

不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差

無蛋白條帶

抗體孵育不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間

酶失活

直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物

標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低?？煽紤]增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因

試劑之間不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性

一抗失效

選擇在有效期內抗體，幷選擇現配現用的工作液

HRP 抑制劑

所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉

抗體不能識別測試種屬的相關蛋白

購買抗體前應認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白

二抗與一抗不匹配

選擇針對一抗來源種屬的抗體

蛋白條帶信號弱

抗體孵育不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間

酶活性降低

直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物

洗膜過度

洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20

標本中靶蛋白含量太低

增加樣本上樣量

抗體活性降低

選擇有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置

蛋白轉移不充分

可以用麗春紅染膜幷結合染膠（考馬斯藍）后確定條帶是否轉移到膜上或轉移過度，適當調整轉膜的時間和電流

封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型

曝光時間過短

延長曝光時間

HRP 抑制劑

所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉

背景有黑色斑點

抗體與封閉試劑反應

使用前過濾封閉試劑

HRP 偶聯二抗中有聚集體

過濾二抗試劑，去除聚集體

暗背景上白色帶

HRP 含量過高

降低酶聯二抗的濃度

背景有不均勻的白色斑點

轉膜過程中有氣泡存在

仔細檢測，避免存在氣泡

抗體分布不均勻

孵育抗體時使用搖床