預期應用
本試劑盒運用雙抗體夾心 ELISA 法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清液和其他生物液體中 IL7 含量。
需自備的設備及試劑
1.450±10nm 濾光片的酶標儀 （建議儀器使用前提前預熱）2. 單道或多道微量加液器及吸頭
3. 稀釋樣品的 EP 管
4. 蒸餾水或去離子水
5. 吸水紙
6. 盛放洗液的容器
標本的采集與保存
1. 血清：
將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4oC 過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或將上清置于 - 20oC 或 - 80oC 保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：
用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的 30 分鐘內于 2-8oC 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于 - 20oC 或 - 80oC 保存，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：
1）取適量組織塊，于預冷 PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；2）可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入 5-10 mL 預冷 PBS 進行充分研磨，該過程需在冰上進行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融 進一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復 2 次）。
3）將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。
4. 細胞裂解液：
1）貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞（懸浮細胞可直接離心收集）；2）將收集到的細胞用冷 PBS 洗 3 次；
3）物理方法裂解細胞（可先超聲破碎細胞，再反復凍融）：
i 超聲破碎：取適量 PBS 重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。
ii 反復凍融：將待破碎的細胞在 - 20oC 以下冰凍，室溫融解，反復 3 次，使細胞溶脹破碎。
4）將標本于 2-8oC 1500×g 離心 10 分鐘，收集上清備用。
5. 細胞培養上清或其它生物標本：
請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于 - 20oC 或 - 80oC 保存，但應避免反復凍融。
注意：
1. 以上標本均需密封保存，4oC 保存應小于 1 周，-20oC 不應超過 1 個月，-80oC 不應超過 2 個月。
2. 標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。
3. 標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備
1. 使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫 （18-25oC），試劑不能直接在 37oC 溶解。
2. 標準品 （凍干品）：每瓶標準品加入標準品稀釋液 1 mL，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時反復顛倒 / 搓動以助溶解，其濃度為 1000pg/mL。準備 7 個稀釋標準品的 EP 管，每個 EP 管中加入 500μL 的標準品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成 1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL，標準品稀釋液 （0ng/mL） 直接作為空白孔。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
3. 檢測溶液 A 及檢測溶液 B：Detection A 及 Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液 A 或 B1:100 稀釋 （如：10μL 檢測溶液 A/990μL 檢測稀釋液 A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制 （100μL / 孔），實際配制時應多配制 0.1-0.2 mL。
4. 濃洗滌液：用 580 mL 蒸餾水或去離子水將 20 mL 濃洗滌液稀釋至 600 mL，進行 30 倍稀釋。
5. 底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的 TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應予丟棄，不要倒回 TMB 瓶中。
注意：
1、 標準品的稀釋不能直接在板中進行。
2、 標準品請于臨用前 15 分鐘內配制。該標準品只能使用一次。
3、 標準品、檢測溶液 A 工作液、檢測溶液 B 工作液請使用相應的稀釋液配制，不能混淆。混勻時要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實驗結果的準確請使用微量吸管，并校準微量加液器。請依據所需的量精確配制，盡量不要微量配制 （如吸取檢測溶液 A 時，一次不要小于 10μL），以避免造成濃度誤差。
4、 請勿重復使用已經稀釋過的標準品、檢測溶液 A 工作液和檢測溶液 B 工作液。
5、 濃洗滌液中如有結晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結晶完全溶解再進行配制。
6、 試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質量差或水質污染，以及實驗中所用耗材潔凈度差，可能造成實驗結果不準確，甚至完全錯誤，請使用雙蒸水。
操作步驟
1. 加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔 7 孔，依次加入 100μL 不同濃度的標準品 （見試劑準備 2）。空白孔加 100μL（見試劑準備第二步最后一管），余孔加待測樣品 100μL，酶標板加上覆膜，37oC 溫育 2 小時。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3. 每孔加檢測溶液 A 工作液 100μL（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37oC 溫育 1 小時。
4. 棄去孔內液體，每孔用 300μL 的洗滌液洗滌，浸泡 1-2 分鐘，吸去 （不可觸及板壁） 或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次 （也可輕拍將孔內液體拍干），重復洗板 3 次。最后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。
5. 每孔加檢測溶液 B 工作液 （臨用前配制）100μL，加上覆膜，37oC 溫育 1 小時。
6. 棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 4。
7. 每孔加底物溶液 90μL，酶標板加上覆膜，37oC 避光顯色 （反應時間控制在 15-25 分鐘，不要超過 30 分鐘。當標準孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔梯度不明顯時，即可終止）。
8. 每孔加終止溶液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。
9. 在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度 （O.D. 值）。
注意：
1. 試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。
2. 加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的「預溫育」時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間 （包括標準品及所有樣品） 最好控制在 10 分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。
3. 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4. 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。
5. 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化 （比如，每隔 10 分鐘觀察一次），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
6. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7. 如果實驗室內濕度低于 60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。
典型數據
為了便于計算，盡管濃度為自變量而 O.D. 值為因變量，我們繪圖時仍采用標準品的 O.D. 值作為橫坐標 （X 軸），標準品的濃度為縱坐標 （Y 軸）。同時為了試驗結果的直觀性，圖中提供的是原始數據而非對數值。推薦使用對數 值建立標準曲線圖。由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術、洗板技術和溫度條件等），標準曲線的 O.D. 值會有所差異。所提供的標準曲線僅供參考，實驗者需要根據自已的實驗建立標準曲線。
人白介素 7（IL7） 檢測試劑盒標準曲線
檢測范圍
15.625-1000 pg/mL
最低檢測限
5.7 pg/mL
此值為 20 個空白樣品 （即標準品稀釋液） 測定的平均值加二倍標準差所對應的濃度。
特異性
本試劑盒用于檢測 IL7，經檢測與其它相似物質無明顯交叉反應。
由于受到技術及樣本來源的限制，不可能完成對所有相關或相似物質交叉反應檢測，因此本試劑盒有可能與未經檢測的其它物質有交叉反應。
穩定性
經測定，試劑盒在有效期內按推薦溫度保存，其活性降低率小于 5%。
為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。
實驗流程
1. 實驗前標準品、試劑及樣本的準備；
2. 加樣（標準品及樣本）100 μL，37℃ 孵育 2 小時；
3. 吸棄，加檢測溶液 A100μL，37℃ 孵育 1 小時；
4. 洗板 3 次；
5. 加檢測溶液 B100 μL，37℃ 孵育 1 小時；
6. 洗板 5 次；
7. 加 TMB 底物 90 μL，37℃ 孵育 15－25 分鐘；
8. 加終止液 50 μL，立即 450 nm 讀數。
警告
本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。