? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?檢測原理
PS正常分布在細胞膜內側,即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期,不同類型的細胞都會把PS外翻到細胞膜外側。用帶有FITC標記的Annexin V,即Annexin V-FITC,就可以通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測到PS外翻這一細胞凋亡的重要特征。
碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑,在嵌入DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細胞膜,但可以穿透壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞。因此,將Annexin V與PI聯合使用時,PI被排除在活細胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)外,而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC和PI結合染色呈現雙陽性(Annexin V+/PI+)。
FITC最大吸收波長為490nm,發射波長為525nm,PI-DNA復合物的最大吸收和發射波長分別為535nm和615nm。
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? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 使用方法
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 01.樣品染色
1.將Binding buffer(10×)稀釋成1×Binding buffer工作液備用(1 mL Binding buffer(10×)需加入9 mL無菌去離子水)。
2.對于懸浮細胞, 500-1000×g 離心 5min 收集細胞。
對于貼壁細胞, 要用不含 EDTA 的胰酶消化細胞, 胰酶消化時間不宜過長或過短,最好是在輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時,加入細胞培養液,將細胞輕輕吹打下來,轉移到離心管內, 500-1000×g離心5min收集細胞。
3.收集細胞后,加入預冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌,離心收集細胞,共洗滌兩次。
4.在細胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液,重懸細胞,使細胞濃度達到 1×10^6 cell/mL。
5.吸取100μL細胞懸液(細胞總數為 1×10^5 cell)至一新管中,加入5μL Annexin V-FITC 和 5-10μL PI,輕輕混勻,室溫避光孵育15min。
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? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 02.樣品檢測
1. 流式細胞儀檢測：染色孵育后,每管加入400μL 1×Binding buffer工作液,混勻后使用流式細胞儀檢測(1小時內檢測)。
建議設置正常細胞、PI單染和 Annexin V-FITC 單染3個對照組,正常細胞組可作為熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。若十字門的位置不易設定,可采用經凋亡誘導的細胞進行設定。結果可用CellQuest等軟件進行分析,繪制雙色散點圖(two-color dot plot),FITC為橫坐標,PI為縱坐標。Annexin V-FITC和PI聯合使用時,活細胞僅有很低強度的背景熒光,早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光,晚期凋亡細胞有綠色和紅色雙重熒光。
2. 熒光顯微鏡檢測：染色孵育后涂片,顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結合的細胞顯示漿膜上有綠色光環。喪失細胞膜完整性的細胞,細胞核顯示紅色,膜上有綠色光環。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 注意事項
1. 可立式離心管內試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體甩至管底,避免開蓋時液體灑落。
2. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)是光敏物質,在保存與操作時請注意避光。
3. 在細胞洗滌的最后一步,請盡量將上清棄凈,以免PBS殘留影響實驗結果。
4. 為獲得準確試驗結果,建議樣品在染色后1小時內進行分析。
5. 為了您的安全和健康,請穿戴實驗防護服、手套、口罩等必要的防護裝備。
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