普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉錄PCR的 基本原理和操作步驟---原位PCR

原位PCR

1?概述

自20世紀80年代中期PCR技術誕生以來,?研究人員就一直探索著將PCR技術與形態學研究結合起來。1990年, A.T. Haase等首創了原位PCR(In situ PCR, ISPCR),?當時稱為?“細胞內PCR”。原位PCR是原位雜交和PCR結合的產物,?兼有二者的優點,?具有較好的靈敏性與專一性,?可同時獲得組織、細胞及染色體的形態結構信息與分子信息,?又能檢測出細胞中單拷貝或低拷貝的DNA、RNA序列。

2 原位PCR原理

原位PCR是通過在單細胞或組織切片上對特異DNA(或cDNA)進行PCR擴增,?然后采用原位雜交或免疫組織化學反應、熒光檢測等技術進行細胞內特定核酸序列的檢出及定位的分子技術。原位PCR技術的待檢標本一般先經化學固定，以保持組織細胞的良好形態結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內或細胞核內，以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板，于原位進行擴增。擴增的產物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜內外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數極擴增，擴增的產物就很容易被原位雜交技術檢查。

3 原位PCR類型

3.1 ?直接原位PCR?

直接原位PCR是使用標記的引物或游離核苷酸進行原位PCR反應,?這種標記分子隨后進入擴增產物中,?擴增結果可直接觀察而不需要進行原位雜交(圖1)?。

優點：

（1）操作簡便；

（2）流程短；

（3）省時。

缺點：

（1）易發生引物錯配或非特異性退火,?容易出現假陽性;

（2）標記的引物會降低PCR效率。

3.2 ?間接原位PCR

間接原位PCR是在沒有標記物的情況下進行PCR反應,?擴增反應結束后,?再用原位雜交技術來檢測擴增的信號(圖1)。

優點：可以克服由于DNA修復或引物錯配引起的非特異性問題,?成為目前最廣泛使用的方案。

缺點：需要進行擴增反應后的洗脫和原位雜交過程,?所需時間相對較長。

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圖1 ?直接原位PCR和間接原位PCR

3.3?原位反轉錄PCR

在原位?PCR?中加上一步反轉錄過程(RT) ,?新形成的cDNA作為模板用于擴增,?這個過程叫做原位反轉錄PCR( in situ reverse transcription PCR,?簡稱原位RTPCR)。它又分為直接原位RTPCR和間接原位RTPCR兩種(圖2)。

原位RT?PCR可用來檢測細胞或組織中低拷貝的mRNA或特異基因的表達。

Tips：在原位?RTPCR?中,?首先要對組織樣品進DNA?酶處理,?以破壞組織細胞中的DNA。

圖2 ?原位反轉錄PCR

3.4??PCR原位再生式序列復制反應

Zebe等1994年率先提出了原位再生式復制反應( Selfsustained sequence replication reaction,?簡稱3SR反應)。它可作為原位RTPCR的一種選擇方法用于完整的細胞和組織切片中低拷貝數mRNA的檢測。

優點：有利于與免疫組織化學相結合。

4?植物原位?PCR?技術的操作步驟?

植物原位?PCR?的基本步驟包括標本制備、預處理、原位擴增、后處理和檢測等。

4.1?標本制備

固定劑的選擇和固定的時間、溫度因材料標本不同而各異。但固定條件的確定,?必須同時滿足?2?個條件:

①保持染色體、細胞和組織標本形態結構的完整性;

②將原位程序中擴增效率的損失減到最小。

Tips：

①對于DNA的原位?PCR,?交聯型固定劑(福爾馬林、4%多聚甲醛、中性甲醛)較為適宜。交聯型固定劑較利于蛋白質和核酸互相交聯,?使擴增產物保留在原位,防止其向細胞外擴散或被洗脫。

②固定時的溫度也會對結果產生影響,?室溫或?37℃固定24～48 h,?可獲最強信號。

③標本的年齡對實驗結果影響也很大,?最好采用新鮮制備的不超過1個月的染色體標本。用新鮮固定的細胞做原位?PCR,?要比存檔的石蠟切片做原位?PCR?敏感得多。

4.2?預處理

預處理可增加細胞的通透性,?促使反應試劑進入細胞內,?并使待擴增的靶序列暴露。在進行消化處理時,?酶種類的選擇、濃度、溫度和處理時間等條件的優化對于原位PCR都很重要。

Tips：

①胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K均可用于消化。推薦使用胃蛋白酶或胰蛋白酶,?因為蛋白酶K較難失活且易引起過度消化,?而胃蛋白酶、胰蛋白酶在以后的洗滌步驟中,?可通過提高pH抑制其活性,?或通過加熱使其失活。

②酶處理的方法取決于固定劑和標本類型。多聚甲醛和戊二醛固定的材料比FAA固定的材料需更長的酶處理時間,?且具小液泡的