?描述：
無(wú)表面活性劑動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒，由優(yōu)化細(xì)胞裂解液和離心管柱及 2.0ml?接收管組成， 能夠快速?gòu)膭?dòng)物細(xì)胞（昆蟲/哺乳動(dòng)物/其他培養(yǎng)細(xì)胞）和組織（無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物）中提取總蛋白。蛋白提取緩沖液中不含任何表面活性劑和 EDTA。試劑盒使用離心管柱**技術(shù)，樣品量最小可處理 20ul，最大可達(dá) 500ul，解決了用戶起始原料限制的因素。操作時(shí)間小于 5?分鐘，產(chǎn)率可到 1-5?mg/ml。
緩沖液配方：非公開
應(yīng)用：
可應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究(LC/MS), IP, ELISA，2D 分析，等電聚焦，SDS-PAGE，immunoblottings 及其他應(yīng)用。試劑盒提供了一個(gè)非?？焖僦苽涓邼舛瓤偟鞍椎姆椒āＳ捎诘鞍桩a(chǎn)量高，且低鹽濃度，提取出的蛋白無(wú)需脫鹽和濃縮，即可直接用于下游應(yīng)用。緩沖液配方：非公開
試劑盒組分
- 15ml?緩沖液A
- 15ml?緩 沖 液 B
- 50?個(gè)離心管柱
- 50?個(gè)收集管
- 4 根塑料研磨棒
儲(chǔ)存：
儲(chǔ)存于 4℃重要產(chǎn)品信息
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?無(wú)表面活性劑動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒可以快速提取總蛋白，因此蛋白酶抑制劑不是必須加入，但是如果下游實(shí)驗(yàn)需要較長(zhǎng)時(shí)間或者蛋白提取后保存較長(zhǎng)時(shí)間，建議在Buffer?A?中添加蛋白酶抑制劑。推薦使用BCA（Pierce）試劑盒用于蛋白濃度測(cè)定。研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入 Buffer?A 中。
所需附加材料
1XPBS
渦旋震蕩儀臺(tái)式離心機(jī)
BCA 蛋白定量試劑盒（Pierce, Cat # :23227）
操作方法：
細(xì)胞樣品總蛋白提取- 非貼壁細(xì)胞
- 蛋白提取前，將Buffer 和離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷。
- 低速離心收集細(xì)胞，在離心管中加入 1ml?預(yù)冷的 PBS,3000rpm?離心 2-3?分鐘清洗細(xì)胞。吸去上清，剩余與細(xì)胞體積相同體積的PBS。渦旋震蕩重懸細(xì)胞。
- 加入表格 1?中相應(yīng)體積的 Buffer?A，渦旋震蕩 10-20?秒裂解細(xì)胞。加入同等體積的 Buffer?B?到管中震蕩混勻。
請(qǐng)注意：部分未完全裂解的細(xì)胞不會(huì)影響樣品質(zhì)量。
- 將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，14000-16000rpm?離心 30?秒-1?分鐘取出。棄去離心管柱，將接收管中溶液轉(zhuǎn)移到新的離心管中保存。蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 1，不同細(xì)胞體積應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液
| 細(xì)胞體積（ul） | 緩沖液 A（ul） | 緩沖液 B（ul） |
| 5 | 20 | 20 |
| 10 | 50 | 50 |
| 20 | 100 | 100 |
| 30 | 200 | 200 |
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- 貼壁細(xì)胞
- 將緩沖液和離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷
- 貼壁細(xì)胞生長(zhǎng) 90-100%融合，將預(yù)冷的 PBS?直接加入培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗貼壁細(xì)胞，吸去上清。
- 按照表 2?中將相應(yīng)體積的 Buffer?A?均勻的加入整個(gè)器皿表面，將器皿放在冰上 2?分鐘，加入等體積的 Buffer B。用吸頭將細(xì)胞刮下混勻后，將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，14000-16000rpm?離心 30?秒-1?分鐘取出。棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 2，不同貼壁細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液
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| 器皿 | Buffer A（ul） | Buffer B（ul） |
| 96 孔板 | 25 | 25 |
| 24 孔板 | 125 | 125 |
| 6 孔板 | 250 | 250 |
動(dòng)物組織總蛋白提取
以下步驟是從 10-20mg 動(dòng)物組織中提取，對(duì)于昆蟲樣品，例如果蠅，使用 15-20 個(gè)幼蟲，蛹或成蟲樣本。如果起始量較大或者較小，需調(diào)整相應(yīng)裂解液的用量比例。
- 將Buffer?和離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷
- 將 10-20mg?新鮮/冷凍組織放置于離心管柱上，加入 200ul?Buffer?A?到離心管柱上，用塑料棍扭轉(zhuǎn)研磨 50-60 次，加入 200ul?Buffer?B?到離心管柱中，繼續(xù)研磨 30-60?次。注意：塑料研磨棒可以重復(fù)使用，用蒸餾水徹底沖洗干凈，用紙巾擦干。
- 蓋上蓋子，14000-16000rpm?離心 30?秒-1?分鐘取出。棄去離心管柱，將接收管中的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到新管中保存，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。