蛋白免疫印跡雜交（Western Blot WB）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。其中的步驟包括蛋白樣本提取制備，蛋白定量，電泳，轉膜與顯色。

凱基公司根據客戶的需求最新推出凱基蛋白提取和SDS PAGE凝膠電泳試劑盒（KGP113）和凱基western blotting 檢測試劑盒 (KGP1201和KGP1202)兩個western檢測的組裝試劑盒，客戶只需準備好樣本、一抗和顯影等試劑，就可輕松完成整個western的操作流程，再也不用操心western過程中某種試劑的缺失問題。

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??? 下圖就是采用KGP113和KGP1201試劑盒檢測一個藥物的干預后細胞中Bcl-2的表達量。

??? 凱基公司同時還向客戶提供Western blotting過程中每個環節所需的試劑。

一、???????????? 蛋白樣本提取制備

凱基的蛋白提取試劑盒包括細胞裂解液、復合蛋白酶抑制劑、復合磷酸酶抑制劑等，除常規的EDTA、EGTA、Sodium orthovanadate、Sodium fluoride、Leupeptin、Pepstatin A、Aprotinin和PMSF，等組份之外，還添加了E-64 Protease、Cantharidin和α-phenauthrolire等蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，可以更有效地抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用，使客戶提取的蛋白無降解的后顧之憂。Lysis buffer中由復合表面活性劑組成，含有非離子型和兩性離子型表面活性劑，能很大程度提高蛋白提取的效率。全蛋白抽提試劑盒獲得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后續研究，但不能用于蛋白激酶的研究。核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒可同時獲得樣本的核蛋白和胞漿蛋白，提取的蛋白可用于進一步的轉錄因子活性分析、凝膠阻滯實驗(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting。膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒可同時獲得樣本的膜蛋白和胞漿蛋白，其中的膜蛋白包括不僅含細胞膜蛋白，也含胞器質膜蛋白，可用于PAGE電泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后續研究。

除了上述的細胞和組織樣品的蛋白提取，凱基公司還推出了細菌、酵母、植物蛋白抽提試劑盒和細胞亞組份蛋白抽提試劑盒。

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KeyGEN公司最新推出簡便型用蛋白提取的各種細胞裂解液，包括蛋白提取的常規去污劑和抑制劑，如：NP-40 、EDTA、EGTA、Sodium orthovanadate、Sodium fluoride、Leupeptin、Pepstatin A和Aprotinin，可用于常規WB的細胞裂解提取蛋白，操作步驟簡便，經濟實用。

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二、???????????? 蛋白定量

凱基的蛋白定量試劑盒包括Braford蛋白含量檢測試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒和Lowry法蛋白

含量檢測試劑盒三個系列，使客戶在電泳前做到心中有數。根據組織細胞裂解或勻漿所使用的方法及裂解液的不同選用，因為去垢劑和還原劑等對不同蛋白濃度測定方法的影響差別很大。如使用凱基公司生產的蛋白提取試劑盒或者裂解液，建議使用凱基BCA蛋白濃度測定試劑盒。

三、???????????? 電泳

凱基公司為您準備了所有電泳的試劑，包括上樣buffer，SDS-PAGE配膠試劑盒，電泳buffer、蛋白

Marker和蛋白染色試劑盒。

第一步：根據目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度進行凝膠的配制，可以使用凱基SDS-PAGE凝膠配制試劑盒

第二步：進行蛋白變性，樣品先置95℃的水浴加熱5分鐘，接著置冰浴中5分鐘，10000g離心20分鐘，取上清液（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃可穩定保持數月）。蛋白上樣緩沖液可以使用凱基SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)

第三步依次加入預染蛋白質分子量標準和待分析樣品。（加樣時間要盡量短，以

免樣品擴散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。樣品一般在0.75mm厚的膠 加樣30-50ug/lane)。為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染蛋白質分子量標準，如凱基預染蛋白分子量 Marker和預染彩色蛋白分子量 Marker。

?? 第四步：電泳。加樣完畢，選擇適當的電壓進行電泳。電泳時通常在濃縮膠時使用低

電壓恒壓電泳（40V/cm），而在溴酚藍進入分離膠時使用高電壓恒壓電泳（80V、cm）。電

泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。

四、???????????? 轉膜與顯色

電泳結束后，需進行轉膜，一抗的孵育和洗滌，二抗的孵育和洗滌，最后進行顯色。

1、?? 轉膜：轉膜可以采用PVDF膜。轉膜電泳緩沖液可以使用凱基電轉移緩沖液(10×)。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。

2、?? 膜的封閉(Blocking)

轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的WB洗滌液中，漂洗1～2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。用巴斯特吸管吸盡洗滌液，加入WB封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘或4℃ 封閉過夜。

3、一抗孵育

參考一抗的說明書，按比例用WB一抗稀釋液適當稀釋一抗。用巴斯特吸管吸盡封閉液，不要漂洗，直接加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果效果不佳，可以在4℃緩慢搖動孵育過夜。加入WB洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5～10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，漂洗3～5次，每次5～10分鐘。如果結果背景較高可以適當延長漂洗時間并增加漂洗次數。

4、參考二抗的說明書，按照適當比例用WB二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。用巴斯特吸管吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。加入WB洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5～10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，漂洗3～5次，每次5～10分鐘。如果顯色結果背景較高，可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

5、?? ECL化學發光檢測，可以采用凱基 ECL 檢測試劑盒

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凱基公司向客戶提供常用的內參一抗和常用二抗，全部是進口分裝。

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同時凱基公司還提供各種磷酸化和非磷酸化一抗，具體請詳見公司網址：http://www.keygentec.com.cn

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