免 疫 學 實 驗

實驗一 與免疫相關的細胞形態的觀察

目的要求：

觀察與免疫相關的幾種細胞的形態，了解它們在機體免疫反應中的作用。

實驗器材：

顯微鏡

血液涂片（瑞氏染色）

結締組織切片

方法：

油鏡觀察

一．血涂片的觀察

（A）??? 紅細胞：淡紅色，無核的圓形細胞，因紅血球為雙凹形，故邊緣部分染色較深，中心較淺，直徑7—8微米。

（B）???? 顆粒白血球

嗜中性顆粒白血球：體積略大于紅細胞，細胞核被染成紫色分葉狀，可分1—5葉，核葉之間聯以染色質細絲，染色質染成粉色，其中充滿細小的大小均勻的顆粒被染成紫紅色。直徑10—12微米。

嗜酸性顆粒白血球：略大于嗜中白血球，細胞核染成紫色，通常為2葉，胞質充滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色。直徑10—15微米。

嗜堿性顆粒白血球：體積略小于嗜酸性白血球，細胞質中有大小不等被染成紫色顆粒，顆粒數目較嗜酸性白血球的顆粒少，核為1—2葉染成淡蘭色。直徑10—11微米。

（C）??? 無顆粒白血球

淋巴細胞：涂片中可觀察到中、小型兩種。小淋巴細胞與紅血球大小相似，圓形。其中含致密的核，染成深紫色。周圍僅有一薄層嗜鹼性染成淡藍的細胞質。中淋巴細胞較大，有較寬層的細胞，核圓形。6-8微米。

單核細胞：體積最大，細胞圓形。胞質染成灰藍色。核呈腎形或馬蹄形，染色略淺于淋巴細胞的核。直徑14-20微米。

二．肥大細胞的觀察（示教）

胞體較大，呈卵圓形，胞質內充滿粗大均等的嗜鹼性顆粒。其中含肝素、組織胺等物質。常成群地分布于血管的周圍。

三．漿細胞的觀察（示教）

細胞呈圓形或卵圓形，胞質豐富，呈嗜鹼性。核圓形，著色深，多偏于細胞的一側，染色質核膜呈車輪分布。正常組織漿細胞少，慢性炎癥時增多。漿細胞合成和分泌抗體，對免疫有重要意義。

四．巨噬細胞：又稱組織細胞，細胞形態不規則。常伸出短而鈍突起，有很強的吞噬能力。

附：

瑞特氏染色：

1．染色液配置

稱取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，過濾。貯褐色瓶中備用。（配置時，要先將瑞特氏染料置研缽體內邊研邊滴加甲醇，使染料溶液得更好。）

2．瑞特氏染色法：

取小鼠骨動脈血，涂制玻片。干后用玻璃筆在涂處之兩側劃線（限制染液流掉）。于劃線內部滴加染液3-4滴，經3-5分鐘后，再滴加等量的蒸餾水，輕輕晃動混合。經5分鐘后，用蒸餾水洗凈，待干后用油鏡檢查。

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實驗二?? 沉淀反應

可溶性抗原與相應的抗體混合，在電解質存在的條件下，兩者比例適合，即可有沉淀物出現，叫沉淀反應（Precipitation）.由于沉淀反應抗原多系膠體溶液。沉淀物主要是由抗體蛋白所組成。

為了求得抗原與抗體的適宜比例，保證有足夠的抗體，而且抗原分子小，具有較大的反應面積，因此操作上通常是稀釋抗原，不稀釋抗體。

沉淀反應的種類有環狀沉淀、絮狀沉淀、莢膜膨脹、瓊脂擴散及免疫電泳等。此外還有放射性同位素標記、酶標記等測定法。

（一）環狀沉淀反應

當抗原與相應抗體形成一個接觸面時，如二者比例適當，接觸面上可形成一個乳白色的環狀物即為陽性沉淀反應。

材料：

1.???????? 免疫血清：免疫兔抗人血清

2.???????? 抗原：人血清

3.???????? 小沉淀管、毛細吸管、橡皮頭、生理鹽水。

方法：

1.???????? 取小沉淀管2只，以毛細吸管吸取抗人血清約0.2毫升，加入第一管，加時注意不能有氣泡。

2.???????? 以毛細吸管吸取生理鹽水0.2毫升加入第二管。

3.???????? 用毛細吸管吸入血稀釋0.2毫升加入各管，加時應注意使抗原溶液緩緩由管壁流下，輕浮于血清面上，使成一明顯界面，切勿使之相混。

4.???????? 置室溫中10—20分鐘，觀察液面有無乳白色沉淀環，若有則為陽性。

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（二）.瓊脂擴散試驗

瓊脂擴散是抗原抗體在凝膠中所呈現的一種沉淀反應。

抗體在含有電解質的瓊脂凝膠中相遇時，便出現可見的白色沉淀線。這種沉淀線是一組抗原抗體的特異性復合物。如果凝膠中有多種不同抗原抗體存在時，便依各自擴散速度的差異，在適當部位形成獨立的沉淀線，因此廣泛地用于抗原成分的分析。瓊脂擴散試驗可根據抗原抗體反應的方式和特性分為單向免疫擴散、雙向免疫擴散、免疫電泳、對流免疫電泳、單向及雙向火箭電泳試驗。

（1）????????? 單向瓊脂擴散試驗

材料：

1．診斷血清（抗體：抗人IgG或IgA免疫血清）

2．待檢血清（抗原）：人血清

3．參考血清：全國統一人血清免疫球蛋白參考血清（批號不同，免疫球蛋白含量不同）。

4．其它：生理鹽水、瓊脂粉、微量進樣器、打孔器、玻璃板、濕盒等。

方法：

1．將適當稀釋（事先滴定）的診斷血清與予溶化的2%瓊脂在60℃水浴預熱數分鐘后等量混合均勻制成免疫瓊脂板。

2．在免疫瓊脂板上按一定距離（1.2—1.5厘米）打孔，見圖1。

圖1單向瓊脂擴散試驗抗原孔位置示意圖

1-5孔加參考血清，6-7孔加待檢血清

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3．向孔內滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀釋的參考血清及1：10稀釋的待檢血清，每孔10微升，此時加入的抗原液面應與瓊脂板一平，不得外溢。

4．已經加樣的免疫瓊脂板置濕盒中37℃溫箱擴散24小時。

5．測定各孔形成的沉淀環直徑(mm),用參考血清各稀釋度測定值繪出標準曲線，再由標準曲線查出被檢血清中免疫球蛋白的含量。

（2）????????? 雙向瓊脂擴散試驗

材料：

1．診斷血清：兔抗人血清

2．待測血清：人血清

3．陰性對照血清

4．其它：生理鹽水、瓊脂粉、載玻片、打孔器、微量進樣器等。

方法：

1．取一清潔載玻片，傾注3.5—4.0毫升加熱熔化的1%食鹽瓊脂制成瓊脂板。

2．凝固后，用直徑3毫米打孔器，孔間距為5毫米?？椎呐帕蟹绞饺鐖D2所示。

圖2 雙向瓊脂擴散原抗體孔位置示意圖

3．用微量進樣器于中央孔加抗體，于周圍孔加各種抗原。加樣時勿使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴散結果。

4．加樣后的瓊脂板收入濕盒內置37℃溫箱中擴散24—48小時。

5．結果觀察：若凝膠中抗原抗體是特異性的，則形成抗原—抗體復合物，在兩孔之間出現一清晰致密白色的沉淀線，為陽性反應。若在72小時仍未出現沉淀線則為陰性反應。實驗時至少要做一陽性對照。出現陽性對照與被檢樣品的沉淀線發生融合，才能確定待檢樣品為真正陽性。

6．結果分析：瓊脂擴散結果受許多因素影響。

①抗原特異性與沉淀線形狀的關系：在相鄰兩完全相同的抗原與抗體反應時，則可出現兩單沉淀線的融合。反之，如相鄰抗原完全不同時，則出現沉淀線之交叉；兩種抗原部分相同時，則出現沉淀線的部分融合。見圖3。

圖3 雙擴散試驗結果示意圖

A：已知抗體? a、b：陽性對照

c、d、e、f：被檢材料

②抗原濃度與沉淀先導形狀的關系：兩相鄰抗原濃度相同，形成對稱相融合的沉淀線；如果兩抗原濃度不同，則沉淀線不對稱，移向低濃度的一邊。見圖4。

???????? ????????圖4 抗原特異性與沉淀線形狀的關系

?????????????????? a、b：抗體? A、A’、B：抗原

?????????????????? A、B完全不同 A、A’部分相同

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③溫度對沉淀線的影響：在一定范圍內，溫度擴散快。通常反應在0-37℃下進行。在雙向擴散時，為了減少沉淀線變形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀線，然后置于室溫或冰箱（4℃）中為佳。

④瓊脂濃度對沉淀線形成速度的影響：一般來說，瓊脂濃度越大，沉淀線出現越慢。

⑤參加擴散的抗原與抗體間的距離對沉淀線形成的影響：抗原、抗體相距越遠，沉淀線形成的越慢，所以在微量玻片法時，孔間距離以0.25-0.5cm為好，距離遠影響反應速度。當然孔距過遠，沉淀線的密度過大，容易發生融合，有礙對沉淀線數目的確定。

⑥時間對沉淀線的影響：沉淀線形成一般在1-3天出現，14-21天出現的數目最多。玻片法可在1-2小時出現，一般觀察72小時，放量過久可出現沉淀線重合消失。

（三）對流免疫電泳試驗

?????? 對流免疫電泳是在瓊脂擴散基礎上結合電泳技術而建立的一種簡便而快速的方法。此方法能在短時間內出現結果，故可用于快速診斷，敏感性比雙向擴散技術高10-15倍。

血清蛋白在PH8.6條件下帶負電荷，所以在電場作用下都向E極移動。但由于抗體分子在這樣的PH條件下只帶微弱的負電荷，而且它的分子量又較大（為r球蛋白）。所以游動慢。更重要的是抗體分子受電滲作用影響較大，也就是說點滲作用大于它本身的遷移率。所謂電滲作用是指在電場中溶液對于一個固定固體的相對移動。瓊脂是一種酸性物質，在堿性緩沖液中進行電泳，它帶有負電荷，而與瓊脂相接觸的水溶液就帶正電荷，這樣的液體便向負極移動?？贵w分子就是隨著帶正電荷的液體向負極移動的。而一般的蛋白質（如血清抗原）也受電滲作用的影響，使泳動速度減慢，但它的電泳遷移率遠遠大于電滲作用。這樣抗原體就達到了定向對流，在兩者相遇且比例合適時便形成肉眼可見的沉淀線。

?材料：

1．診斷血清：免抗人免疫血清

2．待檢血清：人血清

3．陰性對照血清

4．PH8.6,離子強度0.05M的巴比妥緩沖液配置

?????????????? 巴比妥鈉???? 10.3克

?????????????? 巴比妥?????? 1.84克

?????????????? 蒸餾水?????? 1000毫升

5．緩沖瓊脂板：將純化的瓊脂用PH8.6離子強度0.025的巴比妥緩沖液（用0.05M的巴比妥緩沖液稀釋一倍即可）配成1.5%的瓊脂，加入0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱內備用。

6．電泳儀

7．其他：生理鹽水、打孔器、微量進樣器。

方法：

1．瓊脂板的制備根據需要可選用大玻板（6厘米×9厘米）和（小玻片）兩種。大玻板約需瓊脂10毫升，小玻片約需3.5毫升，凝固后按圖打孔，方法同瓊脂擴散試驗。

2．加樣：左側孔內加患者血清（原血清及10倍稀釋血清各占一孔），右側內加抗血清，每片應有陽性對照。

圖5 對流免疫電泳抗原孔、抗體孔位置示意圖

3．電泳

用國產普通電泳儀。其內加0.05mPH8.6的巴比妥緩沖液，加至電泳槽高度的三分之二處，注意兩槽內液面盡量水平。將加好樣品的玻板置于電泳槽上，抗原端接負極，抗體端接正極，用2—4層濾紙浸濕作鹽橋，濾紙與瓊脂板聯接處為0.5厘米。以板寬度計算電流，以板的長度計算電壓。要求電流量為2—3毫安/厘米，即大板為20毫安，小板為10毫安。電壓為4—6伏/厘米。通電45分鐘—2小時后觀察結果。

4．結果觀察：在黑色背景上方，用散射光多個角度觀察，在對孔之間有白色沉淀線即為陽性對照應出現明顯的白色沉淀線。如果抗原，兩極微沉淀條紋不清晰，于37℃保溫數小時可增強沉淀條紋的清晰度。

5．影響結果的因素

（1）???? 抗原抗體的比例：抗原抗體比例適應時容易出現沉淀帶，反之不易發生。當抗體濃度恒定時，被檢血清含甲胎蛋白濃度高時，作10倍、20倍或更高倍數稀釋可以提高陽性率。隨稀釋度的增加，抗原抗體的比例發生變化，沉淀線由靠近抗血清孔向逐步移向兩孔中間，并可出現不典型的沉淀線如弧形、八字須形、斜線形，這些也是陽性，應予注意。

（2）???? 幾組電泳緩沖液其電泳結果以巴比妥鈉—鹽酸緩沖液靈敏度最高。巴比妥—巴比妥鈉次之。Tris緩沖液更差。

（3）???? 電壓與電流時電泳時間需要長些：電壓電流增大時，電泳時間可更短。但電壓過高則孔徑變形，電流過大抗原抗體蛋白易變性，干擾實驗結果。一般選擇每厘米5毫升，電泳時間改為1.5小時。

（四）免疫電泳實驗

免疫電泳實驗是先將抗原物質在瓊脂凝膠中做電泳分離，然后于凝膠槽中加入抗體血清。使抗原抗體進行雙向擴散，在比例適宜部位形成特異的抗原抗體沉淀弧線。每條沉淀弧線代表一組抗原抗體復合物，故可用抗原成分分析；且可以根據其遷移率與抗體所出現的特異反應進行鑒定。

材料：

1．待檢標本（抗原）：正常人血清。

2．抗體：正常人血清的家兔免疫血清。

3．1.5%離子瓊脂（系用巴比妥緩沖液配制的）

4．電泳儀

5．巴比妥緩沖液：

巴比妥1.84克

巴比妥鈉10.3克

蒸餾水1000毫升

pH8.6，離子強度（M）0.05

6．其它：載物玻片，直徑3毫米打孔器，20mmⅹ2mm玻璃鑄型，微量進樣器。

方法：

1.取載物玻片（7.5ⅹ2.5厘米）加上3.5毫升1.5%瓊脂凝膠，制成2毫米厚的瓊脂板。

2.按圖位置，在瓊脂板未凝固時，放入抗血清槽鑄型，注意勿使鑄型全部浸入瓊脂中，待凝固時再打孔。

3.加待檢標本：用微量進樣器往孔中加1—5微升。

4.電泳：電壓9—7伏/厘米，泳動15—20小時。

5.電泳后取出抗血清槽鑄型，加入抗血清，進行雙擴散，一般在24小時內沉淀弧出全。

6．觀察結果：或描繪、拍照或進行染色，染色后的標本便于結果分析及保存。

????????????? ?圖6 免疫電泳抗原孔和抗體槽位置示意圖

（五）火箭電泳試驗

火箭電泳實際是一種定量免疫電泳。其原理為：在電場作用下，抗原在含定量抗體的瓊脂介質中泳動，二者比例在合適時在較短時間內形成狀似火箭或錐形的沉淀線，而此沉淀線的高度常與抗原量成正比關系，因此本法可以測定樣品中抗原的含量。

材料：

1．診斷血清（抗體）：抗人IgG或IgA免疫血清

2．待檢血清（抗原）：人血清

3．參考血清

4．pH8.6，離子強度0.05M巴比妥緩沖液配制（見對流免疫電泳試驗）

5．其它：瓊脂粉，微量進樣器，打孔器，玻璃板，電泳儀

方法：

1．抗體瓊脂板的制備

同單向擴散法，但注意稀釋液應用pH8.6離子強度0.05M的巴比妥緩沖液。

2．打孔見下圖

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?????????????????? 圖7 火箭電泳抗原孔位置圖

3．將用緩沖液稀釋的適宜濃度的參考血清及適當稀釋的抗原（人血清）分別加入各孔中，每孔10或20微升，要求加量準確而不外溢。

4．把加完樣的免疫瓊脂板放入電泳槽中進行電泳，電壓4—6伏/厘米，電泳時間1—5小時，直到大部分抗原孔前端出現頂端尖窄而完全閉合的火箭狀沉淀線，關閉電源。

5．取下瓊脂板，以抗原孔中心為起點，量出各火箭狀沉淀線的高度。同單向瓊脂擴散法繪制標準曲線，查出待檢血清中Ig含量。

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實驗三?? 凝集反應

當顆粒性抗原與其相應抗血清混合時，在有一定濃度的電解質環境中，抗原凝集成大小不等的凝集塊，叫做凝集反應。

凝集反應廣泛地應用于疾病的診斷和各種抗原性質的分析。即可用已知免疫血清來檢查未知抗原，亦可用已知抗原檢測特異性抗體。

一．直接凝集反應

顆粒抗原與抗體直接結合出現凝集現象叫直接凝集反應。

（一）玻片凝集反應

材料：

1．診斷血清：1：10稀釋的傷寒桿菌診斷血清

2．菌種：傷寒桿菌、痢疾桿菌24小時瓊脂斜面培養物

3．生理鹽水、載玻片、毛細吸管

方法：

1．取清潔玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號碼。無菌操作下，用接種環于1、2格內加1：10稀釋傷寒桿菌診斷血清1-2滴，第三格加1-2滴生理鹽水。

2．無菌操作下，用接種環取傷寒桿菌培養物少許，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因為這樣將使診斷血清混入鹽水而影響對照結果），將細菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。此時取菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。

3．同法取枯草桿菌培養物少許，于第二格內混勻。

4．輕輕搖動玻片，經1-2分鐘后肉眼觀察，出現乳白色凝集塊者，即為陽性反應；仍為平等的乳濁液者，即為陰性反應。如結果不夠清晰，可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察。

（二）試管凝集反應

?為一種定量試驗，用已知抗原檢查血清中有無特異抗體，并測定其相對含量。

?材料：

1．診斷血清1：10稀釋傷寒桿菌“H”血清，1：10稀釋傷寒桿菌“O”血清。

2．菌液：傷寒桿菌“H”菌液，傷寒桿菌“O” 菌液。

3．生理鹽水，小試管，吸管。

方法：

1．取潔凈小試管14只分兩排排列于試管架上，每排7只依次用蠟筆注明號碼，于每管中分別加入0.5毫升生理鹽水。

2．在第1排1管中加入1：10稀釋傷寒H血清0.5毫升，于管內連續吹吸3次，使血清與鹽水充分混合，而后吸出0.5毫升注入第2管，同樣予以混勻后吸出0.5毫升注入第3管。依次類推，稀釋到第6管，自第6管吸出0.5毫升棄去。此時，自第1管至第6管的血清稀釋倍數為1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。第7管不加血清作為對照。

3．同法用吸管吸取1：10稀釋傷寒桿菌O血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀釋。

4．用移液管吸取傷寒桿菌H菌液，加收第1排各管中每管0.5毫升（由鹽水對照管開始，依次由后向前加入）此時血清稀釋倍數又增加了一倍。

5．同法于第2排各管中加入傷寒O菌液0.5毫升。

6．將各管振蕩混勻，放37℃水浴箱中2—4小時或37℃孵育箱中過夜次日取出觀察結果。

觀察結果：

1．觀察切勿搖動試管，以免凝集塊分散。

2．先看對照管，此管應無凝集現象，管內液體仍成混濁狀態。但如放置時間較長，細菌堆于管底成小圓點狀，為陰性反應。

3．試驗管應自第1管看起，如有凝集時則于管底有不同大小的圓片狀邊緣不整齊的凝集物，上清則澄清透明或不同程度混濁。凝集的強弱可用“+”號表示如下：

“++++”凝集很強，管內液體完全澄清，凝集塊完全沉于管底；

“+++”凝集強，管內液體不完全澄清稍有輕度混濁，凝集塊沉于管?底；

“++”凝集中等強度，液體半澄清，凝集塊沉于管底；

“+”凝集弱，管內液體混濁，少量凝集塊沉于管底；

“－”不凝集，管內液體和對照管同樣混濁，無凝集塊。

4．輕輕振蕩各管，觀察凝集塊的狀態，對照管的細菌在振蕩時呈煙霧狀上升，隨即消散，細菌分散仍呈混濁狀態?！癏”菌液的凝集塊疏松呈棉狀，大片沉于管底輕搖即升起，并極易破碎?！癘”菌液凝集呈緊密顆粒狀，沉于管底堅實致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒較小不易搖碎。

5．記錄觀察的結果并制定凝集效價。通常以能產生明顯凝集（++）的血清大稀釋倍數作為該血清的凝集效價。如血清的最低稀釋度（即第1管1：40）仍無凝集應報告為低于1：40。如血清的最高稀釋度（即第6管1：1280）仍顯完全凝集現象。，應報該血清效價高于1：1280。

二．間接凝集反應

將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關的顆粒載體上，然后與相應的抗體結合，也可出現顆粒載體的凝集現象，稱為間接凝集反應。間接凝集反應比直接凝集反應敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。

（一）間接血球凝集試驗

間接血球凝集試驗是根據紅血球表面的吸附作用而建立起來的。將細菌可溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時紅血球即稱為“致敏紅血球”。這種致敏的紅血球具有細菌的抗原性，與相應的抗血清相遇可產生凝集現象。

間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質浸出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。但如系蛋白質時則用來吸附的紅血球需先用鞣酸予以處理。

材料：

1．抗原—傷寒桿菌O抗原

2．免疫血清：傷寒桿菌O901免疫兔血清

3．25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等

方法：

1．“O”抗原的制備：

將每毫升100億的傷寒桿菌“O”菌懸液，置100℃水浴中2小時，離心沉淀吸取上清夜，分裝無菌試管，放4℃冰箱備用。

2．致敏紅血球懸液制備：

取一定稀釋度的抗原加等量2.5%綿羊紅血球懸液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分鐘取出振搖一次，共經2小時。然后取出，用生理鹽水洗滌3次，而配制成0.5%懸液即成。

3．試驗步驟：

（1）小試管9只標好號碼于試管架上。

（2）第1管加入0.9毫升生理鹽水，其余各管各加入0.5毫升。

（3）以吸管吸取已加熱滅菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混勻后吸取0.5毫升注入第2管，同樣第2管的血清與鹽水混勻后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀釋直至第8管。自第8管吸出0.5毫升棄去。第9管不加血清作對照。

（4）于每管加入0.5毫升已經致敏的0.5%綿羊紅血球懸液，混勻后放入37℃水浴中2小時后觀察結果。凡最高血清稀釋度的免疫血清試管中呈現完全血凝者，即為該血清的間接血清效價。

（二）間接凝集抑制試驗

若使可溶性抗原與相應抗體先混合，充分作用后再加入有關的免疫微球，因抗體已被可溶性抗原結合，不再出現免疫微球的被動凝集現象，叫間接凝集抑制試驗，臨床化驗檢查中常用的免疫妊娠試驗就是一種間接凝集抑制試驗。

妊娠試驗：

孕婦尿中絨毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此當往尿中加入抗絨毛膜促性腺激素抗體時，由于發生抗原抗體反應的結果，抗體被消耗，此時再往尿中加入膠乳抗原（吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳膠顆粒）。不發生反應，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠試驗陽性。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗體消耗，當膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結合發生反應。出現均勻細小顆粒，妊娠試驗為陰性。

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材料：

1．抗原：吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原

2．抗體：抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清

3．被檢材料：孕婦尿

4．正常尿作對照用

5．黑反應板1塊

6．滴管3只

方法：

1．用清潔滴管在反應板上滴加一滴被檢尿。

2．再往尿滴加抗血清一滴，輕輕搖動，充分混勻。

3．滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動3—5分鐘，在較強光線下，觀察結果。出現均勻一致的細小顆粒為陰性反應，懷孕。

注意事項：

1．試驗材料用具用前使溫度接近室溫（20℃左右）

2．被檢尿太混濁，需要小心過濾。

3．尿中有蛋白及血液時，不宜進行此試驗。

（三）協同凝集試驗

金黃色葡萄球菌細胞壁成分中的A蛋白能與人及多種哺乳動物（豬、兔、羊、鼠等）血清中IgG類抗體 的Fc段結合。IgG的Fe段與SpA結合后，兩個Fab段暴露在葡萄球體表面，仍保持其抗體活性和特異性當其與特異性抗原相遇時，也出現特異凝集現象。在以凝集反應中，金黃色葡萄球菌菌體成了IgG抗體的載體,稱為協同凝集反應.本反應也可用于檢測微量抗原.

A.????? 材料：

1.?????? 抗原:可溶性傷寒桿菌O抗原

2.?????? 免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清

3.?????? 10%CoWan1株金黃色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液

4.?????? PBS0.5%甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等

B.????? 方法：

1．10%葡萄球菌菌懸液的制備：CoWan1株葡萄球菌接種于柯氏瓶，37℃培養18-24小時，用PBS洗下菌苔，每分鐘2500轉速度離心20分鐘。沉淀菌用PBS洗兩次后，用0.5%甲醛（用PBS配置）在室溫中固定3小時。置于80℃水浴中4分鐘以破壞菌體的自源性分解酶。再用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。

2．致敏葡萄球菌：

?1毫升10%的菌懸液加0.1毫升傷寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中30分鐘（中間需搖動兩次）。取出后經每分鐘2500轉速度離心20分鐘，棄去上清液，沉淀菌用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。

3．協同凝集試驗

?取傷寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上混勻，觀察約2分鐘。一般在幾秒鐘內即可發生凝集。

??滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片上，用接種環取傷寒O菌培養物少許置于懸液中使成均勻孔狀，觀察約2分鐘，記錄有無凝集。

?用傷寒“O”桿菌培養物與未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾桿菌培養物與致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均為陰性反應，不出現凝集。

三．凝集吸收

腸道桿菌中的許多細菌都有部分相同的抗原結構。因之一種細菌可與另一種細菌相應的抗血清發生交叉凝集反應。用一種過量的細菌抗原與發生交叉凝集反應的抗血清相結合?？蓪⑵涔餐贵w吸去，剩下抗體只能與特異性抗原起反應，這種試驗即稱凝集吸收試驗。

利用凝集吸收試驗可制備單價因子血清，以進行細菌抗原結構的分析及鑒定菌型。

材料：

1.?????? 免疫血清：1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清。

2.?????? 菌液：腸炎桿菌菌液，傷寒桿菌菌液。

3.?????? 試管、吸管、毛細吸管。

方法：

1.????? 1/10稀釋傷寒桿菌免疫血清分別與腸炎桿菌與傷寒桿菌進行玻片凝集，可見傷寒免疫血清與兩種菌均有凝集，說明二菌具有共同抗原結構，故發生交叉凝集反應。

2.????? 將一定量的腸炎桿菌菌液加入1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清中，放37℃水浴箱中作用2小時，取出后離心沉淀，吸取上清夜，棄去沉淀。

3.????? 將吸收過的上清夜與稀釋腸炎桿菌菌液做玻片凝集，觀察結果。如仍有凝集時則將此上清夜再加濃腸炎桿菌菌液進行吸收，方法如上。

4.????? 重復吸收過的上清夜分別與稀釋腸炎桿菌及傷寒桿菌菌液進行玻片凝集。如與前者無凝集而與后者有凝集，則表示傷寒桿菌免疫血清中的抗腸炎抗體已被完全吸收。

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實驗四??? 溶血反應和補體結合試驗

一．溶血反應

免疫血清與其相應的抗原細胞（血球、細菌及其組織細胞相遇，并在補體的參與下可出現溶細胞反應。依抗原、抗體的種類不同可有溶血反應、溶菌反應等。

溶菌反應只在某些細菌中出現（如霍亂弧菌）。應用溶血反應是補體結合反應中不可少的因素。溶血反應是由于抗原（紅血球）和抗體（溶血素）進行特異性的結合，并吸著了補體，而使紅血球在補體的作用下被溶解，于是產生了溶血現象。

材料：

1.???????????????? 抗原：2%綿羊紅血球。

2.???????????????? 抗體：溶血素

3.???????????????? 補體：取健康豚鼠血清作為補體。

4.???????????????? 小試管、生理鹽水、水浴箱。

方法：

1．取小試管3只，按下表加入各物（容量單位為毫升）

試管	2%紅血球	溶血素（2單位）	補體（2單位）	生理鹽水	結果
1	0.5	0.5	0.5	0.5	?
2	0.4	0.5	——	1.0	?
3	0.5	——	0.5	1.0	?

2．將上述3試管放在37℃水浴箱內15—30分鐘觀察有無凝血現象。

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二．補體結合反應

當抗原與其對應的抗體結合時，所生成的抗原抗體復合物能從溶液中將補體吸著此即謂補體結合。參與補體結合反應的抗原是透明的溶液，故補體結合現象不能被肉眼看出來，因此必須借助溶血系統（溶血素及相對應的羊血球）作為指示劑，來判定媒質中有無游離的補體，近而推定媒質中未知抗原（或抗體）和已知抗體（或抗原）是否進行了特異性的結合。本反應具有很高的敏感性及特異性，因之常應用于傳染病的診斷，特別診斷病毒疾病和梅毒。

?由于參與本反應的各種成分間有著一定量的關系，因此在作本試驗之前，必須通過一系列的預備實驗來確定各成分的使用量，故本反應的實驗方法較為復雜。

本次實驗以傷寒桿菌免疫血清與其相對應的抗原補體結合試驗為例。

材料：

1.???? 抗原：傷寒的抽出液

2.???? 抗體：傷寒桿菌的免疫血清

3.???? 補體：豚鼠血清

4.???? 溶血素：抗綿羊血細胞的兔血清

5.???? 2%綿羊紅血球

6.???? 小試管、試管架、水浴鍋。

方法：

（一）預備試驗（示教說明）

預備試驗包括溶血素效價的滴定，補體效價的滴定，抗原效價的滴定及被檢血清的處理。

（1）???? 溶血素效價的滴定

按照下表加入各物

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管號	溶血素（ml）	溶血素 稀釋倍數	1：20 補體?（ml）	生理 鹽水?（ml）	2%羊血球（ml）	?	假定結果
1	0.5	1：300	0.3	1.7	0.5	搖勻后置37?℃水浴一小時	全溶解
2	0.5	1：500	0.3	1.7	0.5		全溶解
3	0.5	1：800	0.3	1.7	0.5		全溶解
4	0.5	1：1000	0.3	1.7	0.5		全溶解
5	0.5	1：1200	0.3	1.7	0.5		全溶解
6	0.5	1：1600	0.3	1.7	0.5		全溶解
7	0.5	1：2000	0.3	1.7	0.5		全溶解
8	0.5	1：2400	0.3	1.7	0.5		全溶解
9	0.5	1：3200	0.3	1.7	0.5		全溶解
10	0.5	1：4000	0.3	1.7	0.5		?
11	0.5	1：4800	0.3	1.7	0.5		?
12	0.5	1：6000	0.3	1.7	0.5		?
對照	?	1	0.3	2.2	0.5		?

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凡最高稀釋度的溶血素可呈現完全溶血者為一個單位。依上表結果第10管（即1：4000倍稀釋）0.5毫升溶血素為一個單位，在溶血反應中常用0.5毫升中含有2個溶血素單位的溶液，所以試驗時應取1：2000倍稀釋的溶液。

（2）???? 補體單位滴定

依下表加入各試劑：

管 號	補體 (1：20)（ml）	抗原 (ml）	生理鹽水(ml）	置 于 37? ℃ 水 浴 45 分鐘	溶血素 (2單位）（ml）	2%羊血球懸液（ml）	置 于 37 ?℃ 水 浴 15 分鐘	結果
1	0.20	0.5	1.30		0.5	0.5		不溶血
2	0.25	0.5	1.25		0.5	0.5		稍溶血
3	0.30	0.5	1.20		0.5	0.5		全溶血
4	0.35	0.5	1.15		0.5	0.5		全溶血
5	0.40	0.5	1.10		0.5	0.5		全溶血
6	0.45	0.5	1.05		0.5	0.5		全溶血
7	0.50	0.5	1.00		0.5	0.5		全溶血
8	-	0.5	1.50		0.5	0.5		不溶血

能引起完全溶血的最小補體量稱為準確單位，上表中第3管（即0.3毫升），但因補體的效價可能有部分損失，故普通稍高的一管為實用單位，實際試驗時須用兩個實用單位。

上表的結果為：

補體標準單位：0.3毫升

補體實用單位：0.35毫升

補體兩個實用單位：0.70毫升

因試驗時是兩個實用單位的補體0.5毫升，可依下列比例關系換算：

20：0.7=ⅹ：0.5

ⅹ= 14.3

即須將補體稀釋14.3倍，用0.5毫升則含有兩個實用單位。

（3）???? 抗原的滴定

在用已知抗原測定未知抗體時，必須先滴定抗原效價以決定本試驗時所需抗原的最適濃度（反之用已知抗體測定未知抗原時，則需滴定抗體效價）

試??????? 管號 劑	1	2	3	4	5	6
1：5稀釋血清	0.5	0.5	0.5	－	－	－
傷寒抗原2U	0.5	－	－	0.5	－	－
痢疾抗原1：80	－	0.5	－	－	－	－
補體2U	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
生理鹽水	－	－	0.5	0.5	1.0	1.5
搖勻放置37℃水浴中30min
溶血素2U	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	－
2％羊血球	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
搖勻放置37℃水浴中15min
說明	試驗管	特異性對照	血清 對照	抗原 對照	溶血素對照	羊血球對照

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如血清對照管呈完全或部分不溶血是為抗補體現象。血清嚴重污染細菌，混有淋巴液或顯著溶血時，常產生很強抗外體作用。又如試管、吸管不清潔，也可出現抗補體。若有抗補體發生，應抽血重試驗。

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實驗五? T、B淋巴細胞分離試驗

淋巴細胞主要分T淋巴細胞和B淋巴細胞兩大亞群，它們具有不同的特性和功能，為此在進行某些免疫學實驗時，首先需分離出純的T淋巴細胞和B淋巴細胞。本試驗的原理為：淋巴細胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡稱AET）處理的綿羊紅細胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固穩定而巨大的E—花環，較正常未處理的SRBC形成的E—花環百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復性好。再經淋巴細胞分層液分離時，AET—E花環易沉于管底，而未形成E—花環的T淋巴細胞，用低滲液解花環周圍的??? AET—SRBC，便可獲得純T淋巴細胞，而B淋巴細胞可直接取自分層液的界面。

材料及試劑：

a)???????? 新鮮豚鼠血

b)???????? 兔紅細胞（RRBC）

c)???????? 溴花二氨基異硫氫化物（AET）

d)???????? 淋巴細胞分層液

e)???????? 其它Hanks液，含小牛血清的199培養液，無菌生理鹽水，3.5%氯化鈉溶液，離心機等。

方法：

1.???? AET—RRBC制備

（1）. AET溶液的制備

稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，使成為0.143M溶液，用4N NaOH溶液調pH9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。

（2）. AET處理RRBC

取洗滌好壓積的RRBC，按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口（1—2厘米）1800轉/分離心5分鐘。連續洗滌3—5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET—RRBC粘附成團，并觀察有無溶血。若有溶血現象，則用含小牛血清的199培養基再洗一次，最后配成10%AET—RRBC懸液，置4℃保存，不得超過5天。

（3）.1%AET—RRBC的配制：

將預先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培養液稀釋至1%。

2.???? 從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞，操作見后試驗。

3.???? AET—E花環試驗：

將分離的單個核細胞（2ⅹ10⁶/毫升）與等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數管，每管2—3毫升，低速離心（1000轉/分鐘）5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。

4.???? T淋巴細胞和B淋巴細胞的分離

將形成E—花環的細胞懸液，再用淋巴細胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細胞，即為富含B淋巴細胞群。沉淀于管底的E—花環，用Hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E—花環周圍的RRBC，立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含T淋巴細胞群。

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實驗六?? 豚鼠T淋巴細胞的測定

——兔紅細胞玫瑰花環試驗

玫瑰花環試驗，又稱為花結試驗。是測定淋巴細胞數量和功能的一種方法。

人類T和B淋巴細胞表面具有不同的受體。由于人類T淋巴細胞表面具有與綿羊紅細胞結合的受體，能與綿羊紅細胞非特異性結合，形成E花環，因此，T細胞也成為紅細胞花瓣形成細胞。根據E—玫瑰花環形成率，可以間接判斷機體細胞免疫力。目前，已廣泛應用于臨床，作為測定人群免疫狀態的一個指標。

材料：

1.???? 肝素（100單位/毫升）

2.???? 0.5%兔紅細胞懸液（用Hanks液配制）

3.???? 吸收過的胎牛血清：

取經56℃30分鐘加熱滅活后的胎牛血清加半量壓積兔紅細胞混合后，37℃水浴20分鐘，2000轉/分離心10分鐘，取上清液即成。

4.???? Hanks液

5.???? 豚鼠抗凝血

6.???? 淋巴細胞分層液

7.???? 滅菌注射器，針頭，試管，吸管等。

方法：

1.????????? 淋巴細胞提取

（1）???????????? 取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀釋。加于3毫升淋巴細胞分層液液面之上（沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混）。

（2）?????????? 2000轉/分離心30分鐘，吸淋巴細胞層到另一試管中加5倍體積的Hanks液洗1—2次，（1500轉/分離心10分鐘）棄上清即成。

圖8 用分層液離心后的血細胞層

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2.????????? 加吸收過的胎牛血清0.1毫升，0.5%兔紅細胞懸液0.2毫升，于淋巴細胞中?；旌虾?，37℃水浴5分鐘。

3.????????? 500轉/分離心5分鐘，放4℃冰箱中2小時后，棄大部分上清。

4.????????? 染色及觀察

輕輕懸浮沉積的細胞。向懸液中滴一滴美蘭液，混合，10分鐘后取一滴放載玻片上，加蓋玻片鏡檢。

高倍鏡或油鏡下計數200個淋巴細胞，凡結合3個或3個以上的兔紅細胞者為陽性，計算花環形成細胞的百分率。

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實驗七? 酶聯免疫吸附試驗

（ELISA）測定傷寒桿菌“O”抗體

酶聯免疫吸附試驗是用酶標記的抗體（或SPA）檢測未知抗原或抗體的方法。此法敏感性高，特異性強。常用的是ELISA方法，間接法，雙抗體法和抗原法。本次試驗介紹，酶聯葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下，見圖9

圖9 ELISA－SPA法原理

1.????????? 加抗原 使之吸附于固相載體（如塑料反應板）

2.????????? 洗滌 加待測血清

3.????????? 洗滌 加酶標記SpA

4.????????? 洗滌 加酶的底物。經酶的催化產生有色產物。

材料：

1.????????? 聚乙烯塑料反應板（PH9.6時可吸附蛋白Ag）

2.????????? 抗原：傷寒桿菌O901煮沸或超聲波粉碎抗原

3.????????? 待測血清

4.????????? 凍干酶聯葡萄球菌A蛋白（HRD—proteinA）純品

5.????????? 鄰苯二胺（OPD）

6.????????? 包被液：0.05M碳酸鈉—碳酸氫鈉溶液PH9.6

7.????????? 稀釋液：10%免疫血清PBS—吐溫20，防止非特異性吸附

8.????????? 洗滌液：0.02MTrisTWeen20 ,Ph7.4防止非特異性吸附

9.????????? 底物溶液：0.02M磷酸氫二鈉25.7毫升

????????????? 0.1M檸檬酸24.3毫升

蒸餾水50毫升

臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解40毫克鄰苯二胺，然后加入30%雙氧水0.15毫升，底物對光敏感，需要避光并立即使用。

10.?????? 終止液；2M硫酸

方法：

1．抗原包被

取潔凈的聚苯乙烯微量反應板，于每孔內加傷寒抗原0.1毫升（用包被緩沖液稀釋，蛋白含量10微克/毫升），置37℃1小時，棄抗原液，用洗滌液3次每次3分鐘。

2．加待測血清

于每孔內分別加不同稀釋度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待測血清，PBS空白對照，陰性對照血清，陽性對照血清各0.1毫升。置37℃30分鐘，洗滌3次。

3．加酶聯A蛋白

于每孔加酶聯A蛋白各0.1毫升，置37℃20分鐘，洗滌3次。

4．加臨時配制的底物溶液各0.1毫升，置暗處15分鐘。加2M碳酸1滴終止反應。

5.結果判斷：（肉眼判斷）

若顏色于陰性對照相同則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，根據顏色深淺以（+）表示。

綜合設計性實驗

實驗一 抗體產生細胞的檢測——溶血空斑實驗

（綜合性實驗）

取綿羊細胞免疫的小鼠脾臟，制成脾細胞懸液，與一定量的指示細胞（綿羊細胞）和補體結合，注入自制的小室內，經37℃孵育后，單個散在的抗體形成釋放抗體，抗體與周圍的綿羊紅細胞（抗原）結合，并在補體參與下，使綿羊細胞溶解，結果在抗體形成細胞周圍形成肉眼可見的圓形透明溶血區——溶血空斑。計算溶血空斑數目，則可推算脾內存在的抗體產生細胞總數。

材料：

1.? 20—22克健康小鼠

2.? 解剖器械

3.? 注射器，平皿，漏斗，紗布，研缽

4.? 20%綿羊紅細胞懸液

5. ?潔凈脫脂載玻片（75ⅹ25毫米），蓋玻片（22ⅹ22毫米）。

6.? Ph7.2的Hanks液，凡士林油。

7.? 微量加樣器

8.? 指示細胞懸液，配制方法如下：

10%綿羊紅細胞? 0.5毫升

補體（新鮮豚鼠血清）0.5毫升

含5%小牛血清的Hanks液? 2毫升???? 混合后水浴備用

方法：

1．免疫動物

取25%綿羊紅細胞懸液1毫升，無菌操作注入小鼠腹腔中

2．脾細胞液的制備

（1）小鼠免疫4天后，頸椎脫位處死，取脾臟，去除脂肪組織，放平皿內，用冷Hanks液洗1—2次。

（2）取出脾臟研缽中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反復吹打數次，使細胞分散。將此細胞懸液經4—8層紗布過濾，1500轉/分離心5分鐘，棄上清。

如細胞太多，可加蒸餾水4毫升迅速混勻，半分鐘后立即加入等量Hanks液混勻1000轉/分離心10分鐘，棄上清。

（3）沉淀細胞用Hanks液洗1—2次，棄上清后，加Hanks液使總量達5毫升。用乳頭吸管吹打使沉淀細胞懸起混勻，此即為50倍稀釋的脾細胞。

（4）取此懸液0.1毫升放另一小試管中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀釋的脾細胞懸液。

*脾細胞懸液制備過程中應在冰水浴中進行。

3．玻片小室的制作

取潔凈（無油）的載玻片，按下圖粘三條透明膠帶，在膠帶上薄涂一層凡士林（勿涂到小室內），然后用鑷子取兩個蓋片，分別放在其上，制成兩個小室。用鑷子尾端將蓋片壓平貼牢（保持小室一定體積）。用凡士林將蓋片底端（其中的任一端）封住，頂端作為注入細胞混合液。

??????????????? 圖10玻片小室示意圖

4．細胞混合液的配制

取小試管一只，用1毫升吸管吸取0.2毫升指示細胞懸液，用另一吸管吸取0.2毫升500倍稀釋的脾細胞懸液，混勻即為被檢的細胞混合懸液。

5．混合細胞的灌注

用100ul的微量加樣器吸取被檢細胞混合懸液，于小室開口一端輕輕將液體注滿小室（勿使氣泡產生，勿使液體外溢），記錄實際注入的細胞懸液微升數（約70ul）

每個樣品注2個小室，取其平均值。

6．用牙簽粘取少許凡士林益封小室開口。

7．將作好的標本水平置濕盒中，放37℃溫箱中孵60分鐘

8．溶血空斑計數

肉眼觀察空斑并計數兩個小室出現的溶血空斑數。對模糊不清的空斑可在低倍鏡下檢查，真正的溶血空斑必須中心有一個淋巴細胞，周圍為透明區。

全脾臟中抗體產生細胞總數可依下述公式計算：

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